A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.
De nombreuses applications biomédicales importantes, telles que l'imagerie cellulaire et la manipulation à distance, peuvent être obtenues par marquage des cellules avec des nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (SPIONs). La réalisation de l'absorption cellulaire suffisante de SPIONs est un défi qui a traditionnellement été rencontré par l'exposition des cellules à des concentrations élevées de SPIONs ou en prolongeant le temps d'exposition (jusqu'à 72 h). Cependant, ces stratégies sont susceptibles de servir de médiateur toxicité. Ici, nous présentons la synthèse du SPION magnetoferritin à base de protéines, ainsi qu'un protocole de fonctionnalisation de surface facile qui permet la magnétisation rapide des cellules en utilisant des concentrations faibles d'exposition. Le noyau de SPION de magnetoferritin est constitué de cobalt dopé d'oxyde de fer ayant un diamètre moyen de particules de 8,2 nm minéralisé à l'intérieur de la cavité de rate de cheval apo- ferritine. cationisation produit chimique de magnetoferritin un roman, SPION fortement à la membrane active qui magnétise les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) en utilisant des temps d'incubation commecourt que les concentrations d'une minute et de fer comme bas que 0,2 mM.
liaison à la surface ou l'internalisation des nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (SPIONs) a permis l'aimantation d'une variété de types cellulaires pour des applications telles que l'imagerie et la manipulation à distance. 1 Toutefois, la réalisation de l' aimantation cellulaire suffisante peut être un défi, en particulier lorsque l'interaction entre le SPION et la surface des cellules est faible. 2 Dans les concentrations passées, l' exposition prolongée ou haute Spion ont été utilisés comme des stratégies pour surmonter ce défi. 3,4 Néanmoins, ces stratégies sont problématiques car ils augmentent la toxicité 5,6 et ont un succès très limité dans des types cellulaires avec des taux d'internalisation faibles, tels que les lymphocytes. 7 Afin d' améliorer l' absorption cellulaire de SPIONs, les approches de plusieurs fonctionnalisation de surface ont été explorées. Par exemple, les anticorps ont été utilisés pour favoriser l' endocytose médiée par le récepteur 8 , tandis que l' absorption non spécifique peut être obtenue en utilisant une transfectiongents 9,10 ou des espèces de pénétration cellulaire, telles que le VIH tat-peptide. 11,12 Cependant, les approches d'anticorps et le peptide fonctionnalisation sont limitées par des réactifs coûteux et complexe préparation synthétique, tandis que les agents de transfection peuvent induire la précipitation des nanoparticules et affecter négativement la fonction cellulaire. 13,14
Nous avons récemment rapporté la synthèse de magnetoferritin cationisé chimiquement, un roman SPION qui était très efficace dans les cellules de magnétisation souches mésenchymateuses humaines (CSMh) en utilisant des temps d'incubation aussi courtes qu'une minute. 15 Magnetoferritin est synthétisé en reconstituant une SPION intérieur de la cavité déminéralisé de la protéine de stockage du fer de la ferritine. 16 Cette SPION à base de protéines combine de nombreuses propriétés qui le rendent bien adapté pour la magnétisation de la cellule, tels que le contrôle des propriétés magnétiques du noyau magnétique, 17-19 et la biocompatibilité et la solubilité aqueuse conférés par l'enveloppe protéique. Plus loinplus, fonctionnalisation de surface est facile à réaliser en raison des acides aminés adressables qui peuvent être chimiquement 20-22 ou génétiquement modifiés. 23-25 Nous avons montré que la cationisation chimique des résidus d'acides aminés acides de la protéine d'enveloppe génère une nanoparticule stable qui interagit avec les domaines facilement anioniques sur la surface cellulaire , conduisant à une aimantation cellulaire rapide et persistante. Cette procédure élimine le besoin de fonctionnalisation laborieux et des protocoles d'incubation longs, et en raison du mécanisme de marquage non spécifique de cette stratégie de magnétisation rapide devrait trouver une application très répandue dans d'autres types de cellules. Ici, nous présentons un rapport en profondeur de la méthode de marquage cellulaire ultra-rapide, y compris les protocoles détaillés de la synthèse, la purification et la surface fonctionnalisation de magnetoferritin cationisé.
MET d'échantillons colorés avec magnetoferritin aurothioglucose a révélé la minéralisation réussie des nanoparticules à l'intérieur de la cage de la protéine. diffraction des électrons et de l'analyse Raman du noyau de la nanoparticule a indiqué la présence d'une ferrite de cobalt, ce qui indique la réussite de dopage du coeur de la nanoparticule avec le cobalt. Ceci démontre que les nanoparticules d'oxyde mixte peuvent être minéralisé avec succès dans la cavité de l'apo-ferritine. En outre, nous avons montré précédemment que le dopage de cobalt peut être modifiée en modifiant la quantité de précurseur de cobalt ajouté au mélange réactionnel, ce qui permet le réglage des propriétés magnétiques. 18
Synthèse Magnetoferritin peut être effectuée dans une variété de vaisseaux, aussi longtemps qu'ils sont étroitement refermable et avoir des ports d'accès par lequel réactifs peuvent être introduits (par exemple, un à trois cols de ballon à fond rond). La température de réaction doit être maintenue à 65 ° C, soit en plaçant le récipient dansa / bain d'huile de l'eau ou à l'aide d'un navire à double enveloppe. Ici, nous avons utilisé une configuration à double enveloppe cellule électrochimique pour effectuer la synthèse. Pour garantir la synthèse réussie, en maintenant le pH correct et d'éviter la contamination de l'oxygène de la solution aqueuse est primordiale. les solutions de sels métalliques doivent toujours être préparés fraîchement avant leur utilisation plutôt que d'avance. En outre, les solutions de apoferritine commerciales peuvent varier en qualité et affecter la synthèse des résultats (par exemple., La taille des nanoparticules noyau minéralisée). Il peut aider à dialyser la solution de apoferritine dans un tampon HEPES 50 mM (pH 8,6) avant la synthèse pour éliminer tout agent réducteur résiduel utilisé par le fabricant. Il est utile de prendre note du nombre de la solution apo-ferritine utilisée pour la synthèse par lots, il peut donc être expressément demandé par le fabricant devrait plus besoin de matériel à acheter. En outre, la concentration de protéine disponible dans le commerce apo-ferritine doit être indiqué sur la bouteille, qui peutêtre utilisé pour calculer le volume de solution apo-ferritine nécessaires pour la synthèse. Si cela est le cas, contactez le fournisseur pour obtenir cette information.
L'avantage de l' addition graduelle des sels métalliques et le peroxyde d'hydrogène – tel que présenté ici et dans les rapports précédents – que la minéralisation du noyau de la nanoparticule peut être commandé de telle sorte que les différents facteurs de charge ( par exemple, la taille des nanoparticules) peuvent être obtenus. 33 En outre, il est possible de purifier davantage magnetoferritin en utilisant une colonne de séparation magnétique, par exemple une colonne garnie de poudre d'acier inoxydable fixé à l' intérieur d' un électro – aimant. 34 Ainsi, les noyaux de nanoparticules hautement monodispersées peut être isolé de l'échantillon de magnetoferritin en vrac. Cependant, pour le marquage cellulaire magnétique présenté ici ne l'exige pas. Une limitation de la synthèse de magnetoferritin est relativement faible rendement de synthèse d'environ 10%, et le coût relativement élevé du commerce apo-fésolutions rritin. Cependant, apo-ferritine peut également être préparé à partir disponible à bon marché de la rate de cheval ferritine en suivant les protocoles de-minéralisation établies. 16
Cationisation de magnetoferritin a été obtenue en ajoutant un rapport molaire de 250 molécules de DMPA et de 50 molécules d'EDC par résidu chargé négativement (calculs basés sur la séquence d'acides aminés de la rate de cheval ferritine). Cet excès de réactif sur la protéine conduit à des rendements de cationisation élevés, comparables aussi précédemment rapporté des résultats pour la cationisation de la ferritine. 35 Pour l' analyse MALDI-TOF, et apoferritine apoferritine cationisé ont été utilisés en raison de la masse moléculaire en excès du noyau de magnetoferritin. Pour obtenir des rendements élevés de cationisation, pH optimal est également crucial. réticulation EDC médiation est le plus efficace dans des conditions légèrement acides, et nous avons trouvé que le pH 5 a donné des résultats de cationisation optimaux pour magnetoferritin. Cependant, pour d'autres protéines cationization pH peut avoir besoin d'être optimisé. Cationisation à ou près du point isoélectrique de la protéine doit être évitée, car cela peut conduire à des fortes précipitations.
Stem aimantation cellulaire avec magnetoferritin cationisée était très efficace et pourrait être réalisé en utilisant des temps d'incubation nettement inférieure à 30 minutes. Même une incubation d'une minute a donné lieu à une teneur en fer de 3,6 pg cellulaire, ce qui est rapporté dans la plage requise pour influencer T2 et T2 * contraste pour l'IRM. 36,37 Il est également remarquable que ce marquage efficace est obtenue avec les concentrations de fer extracellulaire faible. Par exemple, des études antérieures utilisant des nanoparticules anioniques signalent des niveaux de fer de 10 pg par cellule après une période d'incubation de 30 minutes avec du fer 5 mM. 38 A titre de comparaison, l' incubation avec une solution contenant 0,5 magnetoferritin cationisé uM de protéine correspond à une incubation à environ 0,2 mM , du fer et des rendements également approximativement 10 pg de fer par cell au bout de 30 minutes. Nous ne sommes pas en mesure d'identifier clairement les vésicules d'endocytose utilisant TEM. Toutefois, des études antérieures utilisant la ferritine cationisée constaté que l'intériorisation a eu lieu dans les dix premières minutes d'exposition. 39,40 ferritine cationisée pourrait être localisé dans des vésicules enrobées, indiquant endocytose clathrine ou cavéoline-dépendante. Ces mêmes études ont également indiqué que, après 30 minutes d'incubation, la ferritine cationisée était encore présent à la surface des cellules, ainsi que dans les corps multivésiculaires, ressemblant à des lysosomes.
D' autres applications peuvent inclure des cages de cationisation apo-ferritine chargées avec d' autres nanoparticules et / ou des molécules fonctionnelles telles que des médicaments anticancéreux 41 ou 42 points quantiques. Cationisation de ces constructions ferritine pourrait se traduire par une livraison plus rapide et plus efficace de leur cargaison aux cellules.
The authors have nothing to disclose.
This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL |
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL |
ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 mL/min |
automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration |
penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL |
phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells |