ניתוח של ייבוא חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים
Summary
כאן אנו מתארים שיטה חדשה ללמוד יבוא החלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים תחת לחץ. השיטה היא מהירה וישירה, וניתן להחיל ללמוד את ההשלכות של תנאי לחץ שונים לייבוא חלבון הכלורופלסט, ואת מנגנוני ויסות המקביל.
Abstract
כלורופלסטים הם אברונים עם תפקידים חיוניים רבים בצמחים, הכוללים לא רק פוטוסינתזה אבל מטבוליות אחרות רבות ופונקציות איתות. יתר על כן, כלורופלסטים הם קריטיים עבור התגובות הצמח לעקות א-ביוטיים שונים, כגון מליחות מדגיש האוסמוטי. הכלורופלסט עשוי להכיל עד חלבונים שונים ~ 3,000, שחלקם מקודדים על ידי הגנום משלה. עם זאת, הרוב המכריע של חלבונים הכלורופלסט מקודדים בגרעין מסונתז cytosol, וחלבונים אלה צריכים להיות מיובאים לתוך הכלורופלסט דרך translocons על ממברנות המעטפה הכלורופלסט. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הייבוא חלבון הכלורופלסט ניתן לווסת באופן פעיל על ידי מתח. כדי לחקור כגון רגולציה ביוכימית של יבוא חלבון בתנאי קיצון, פיתחנו את השיטה המתוארת כאן כהליך מהיר וברור שניתן להשיג בקלות בכל מעבדה. בשיטה זו, צמחים גדלים תחת אוורור נורמליns ולאחר מכן נחשף למצבי לחץ בתרבות נוזלית. חומר צמחי נאסף, כלורופלסטים הם מכן שוחררו על ידי המגון. את homogenate הגולמי מופרד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות, המאפשר בידוד של כלורופלסטים ללא פגע. תשואה הכלורופלסט נבחנת על ידי ספירה, ו תקינות הכלורופלסט נבדקת במיקרוסקופ. עבור מבחני יבוא חלבון, כלורופלסטים מטוהרים מודגרת עם 35 radiolabeled S בחלבונים מבשר מתורגם במבחנה, וניסויים מנות זמן נערכים כדי לאפשר השוואות של שיעורי הייבוא בין גנוטיפים בתנאי קיצון. אנו מציגים נתונים שנוצרו באמצעות שיטה זו אשר מראה כי שיעור יבוא חלבון לתוך כלורופלסטים מן מוטצית רגולטורית משתנה במיוחד בתנאי קיצון האוסמוטי.
Introduction
כלורופלסטים הם מאוד אברונים בשפע קיימות ברקמות הירוקות של צמחים. הם ידועים עבור תפקיד קריטי שלהם בתהליך הפוטוסינתזה, תהליך העושה שימוש באנרגיית אור כדי להמיר פחמן דו חמצני לסוכר ובכך לתמוך כמעט כל החיים על פני כדור הארץ 1. בנוסף, כלורופלסטים (והמשפחה הרחבה של אברונים הקשורים שנקראים plastids) לשחק הרבה תפקידים חיוניים אחרים בצמחים, כוללים ביוסינתזה של חומצות אמינו, שומנים, פיגמנטים, ואת החישה של אותות סביבתיים כגון כוח משיכה ואתגר הפתוגן. פוטוסינתזה יוצרת (reactive oxygen species ROS) כמו תוצרים, אשר בנסיבות מסוימות יש תפקידים שימושיים, אבל אם overproduced יכולה לגרום השפעות מזיקות או אפילו קטלניות. ייצור יתר של ROS הוא קידם במיוחד על ידי תנאים סביבתיים קשים, וכך כלורופלסטים קשורים קשר הדוק התגובות מדגיש אביוטי, כגון מליחות מדגיש האוסמוטי 2.
Chיש loroplasts מבנה מורכב. הכלורופלסט כל מוקף שכבה כפולה הממברנה חיצונית קראה את המעטפה, אשר מורכבת של ממברנות חיצונית ופנימית. מבחינה פנימית, יש מערכת קרום אחרת שנקראה תילקואיד, שבו תגובות האור של פוטוסינתזה להתרחש. בין שתי מערכות הקרום מתקיימת שיחת תא מימית את stroma, אשר מעורב קיבוע פחמן. הכלורופלסט עשוי להכיל עד ~ 3,000 חלבונים שונים, ואת הרוב המכריע של חלבונים אלה מסנתזים אותן cytosol בצורה מבשר צריך להיות מיובאים לתוך אברון דרך translocons חלבון המוקדש בממברנות המעטפה 1. מעניין לציין, כי העבודה אחרונה הצביעה על כך יבוא הכלורופלסט חלבון מווסת באופן פעיל, ולכן הוא מסוגל להפעיל רמה חשובה של שליטה על proteome הכלורופלסט. לדוגמא, נמסר כי בשנת 2015 יבוא חלבון יכול להגיב ללחץ אביוטי דרך הרגולציה הישירה של השפע של הדואר translocon על קרום המעטפת החיצונית של כלורופלסטים (TOC) על ידי מערכת היוביקוויטין-הפרוטאזום 3.
שימוש כלורופלסטים מטוהרים בחלבונים מבשרים המסונתז במבחנה, יבוא חלבון ניתן מחדש במבחנה 4,5. לפיכך, שיטות חוץ גופייה ניתן להשתמש כדי להעריך את שיעורי יבוא צמחים מוטנטים שונים 6, אשר כבר פועל מתוך תפיסה ביקורתית לניתוח רכיבים המשוערים של מכונות יבוא חלבון על גילוי המנגנונים יבואו חלבון והרגולציה שלה. יתר על כן, יכול להיות מעובד כלורופלסטים עם חלוקה נוספת או העיכול פרוטאז, הבאים במבחנה יבוא, אשר יכול להקל על מחקרים על לוקליזציה המשנה organellar ואת הטופולוגיה של חלבונים הכלורופלסט 7,8.
כדי לחקור את הסדרת יבוא החלבון על ידי מתח, יש לנו שונה שיטת הבידוד הכלורופלסט השגרה שלנו כמו נתארכאן. חשוב לציין, כלורופלסטים בודדו מצמחים שהתפתחו על Murashige הסטנדרטי Skoog (MS) אגרו בינוני במשך 8 ימים ולאחר מכן מועברים לתוך במדיום נוזל MS השלים עם לחץ, מתן טיפול מתח קצר יחסית, מבוקר. התשואה וכשירותו של כלורופלסטים מבודדים מצמחים הלחץ שטופלו כאלה עולים בקנה אחד עם הזרם ב assay יבוא חלבון במבחנה 3. בנוסף פרוטוקול הבידוד הכלורופלסט, אנו מציגים שיטת השגרה שלנו ליבוא חלבון במבחנה, אשר הוכיח להיות חזק והיא בשימוש נרחב 3,9-12.
Protocol
Representative Results
Discussion
הראינו לאחרונה כי יבוא חלבון הכלורופלסט ניתן לווסת באופן פעיל על ידי מתח, שהוא חיוני לתפקוד וצומח הכלורופלסט הישרדות 3. במחקר זה, כדי לפקח תקנה כזו, שינינו בידוד הכלורופלסט שלנו ובשיטות assay יבואו במבחנה על מנת לאפשר הערכה של קיבולת יבוא הצמחים הגדלים בתנאי מתח. התוצאות הצביעו על תפקיד חשוב עבור SP1 בתקנה יבוא חלבון הכלורופלסט.
מבחני יבוא קונבנציונליים במבחנה להשתמש בצמחים הגדלים על מצע אגר MS תקן 6,17,18. במקרה של מוטצית SP1 המתואר כאן, מבחנים קונבנציונליים כגון לא לחשוף את כל הבדלים ביחס יבוא חלבון אל WT 3. עם זאת, את התפקיד של SP1 בויסות יבוא חלבון מתגלה בבירור כאשר יבואו חלבון נבחן בתנאי קיצון באמצעות השיטות שתוארו לעיל (איור 1). אמנם זה מאיים לא ניתן יהיה להשוות נתוני יבוא ישירות assay בתנאי עקה עם אלה המתקבלים מבחנים קונבנציונליים (כמו השיטות להעסיק צמחים הגדלים בתרבית נוזל על מצע אגר, בהתאמה), השוואות בין מתח תנאים שאינם לחץ הם ריאליות ובלבד הצמחים גדלים כל במדיום התרבות באותו הנוזל, עם או בלי לחץ.
בהשוואה לטיפול הלחץ על המדיום אגר, בתרבות נוזל הוא יותר נוח לטיפול של מספר גדול של צמחים הדרושים מבחני יבוא חוץ גופית. יתר על כן, זה מקל על היישום האחיד של גורם דחק לכל הצמחים, וזה חשוב במיוחד עבור טיפולי לחץ לטווח קצר. השיטה המוצגת כאן יושמה ללמוד את הלחץ האוסמוטי באמצעות טיפול מניטול, אבל אפשר להפוך בקלות למגוון רחב של לחצים אחרים; למשל, מתח מלח לטווח קצר סטרס חמצוני, אשר דחק המקבילה יכול bדואר מיושם באופן דומה באמצעות בינוני MS נוזלי. עבור סוגים אחרים של לחצים, אנו מציעים את מידת הלחץ היא מותאמת ראשונה; מדי טיפולים קשים עלולים להיות השלכות שליליות על התשואה ו / או יכולת יבוא של אברונים המבודדים.
ישנם מספר צעדים חשובים בתוך הפרוטוקול שאליו אחד צריך להקדיש תשומת לב מיוחדת, כפי שיפורט להלן.
הריכוז אגר האופטימלי עבור מדיום MS יכול להיות שונה (0.6 – 0.9%, w / v) בהתאם ליצרן. לפיכך, מומלץ לבצע אופטימיזציה של ריכוז אגר אמפירית לפני תחילת הניסויים. המדיום לא צריך להיות כל כך רך כי היא נדבקת אל הרקמה ליד מדרגת הקציר (שלב 1.9), לא צריך להיות כל כך קשה כי זה מעכב התפתחות שורש צמח. ריכוז סוכרוז יכול גם להיות מותאם על פי הצמחים בשימוש. כשעובד עם מוטציות חולות במיוחד, בינוני MS בתוספת 2 – 3% (w / v) סוכרוז עשוי לעזור לצמחים לגדול טוב יותר. כאשר האפליקציהשוכב טיפולי לחץ, זה לא טוב להעביר צמחים ישנים מאוד למדיום הנוזלי (למשל> בן 14 ימים). הסיבה לכך היא כי השורשים המפותחים יותר של צמחים ישנים פגומים בקלות רבה יותר במהלך מסירה.
באשר למערכת תעתיק / תרגום, יש 2 מערכות עיקריות: אלה המבוססים על נבט חיטה, ואלה המבוססים על reticulocyte ארנב. ערכות אלה עשויים להשתמש בתבניות שונות, כגון פלסמידים לינארית, פלסמידים unlinearized, או מוצרים PCR. הערכות גם ספציפיות עבור T3, T7, ומקדמי SP6. ראוי לציין, כי הערכה אנו ממליצים כאן היא מתאימה רק לשימוש עם מוצרי ה- PCR ואת אמרגן T7. עם זאת, מסיבות לא ידועות, כמה preproteins radiolabeled עשה עם המערכת הזו לא יכול לעבוד ביעילות ב assay יבוא; במקרים כאלה, ניתן לשקול לנסות מערכת תמצית נבט חיטה או מערכת lysate reticulocyte מיועד תבניות פלסמיד. אפשר גם לשפר את התוצאה של מחדש שעתוק / תרגוםפעולה על ידי שינוי תנאי תגובה על פי המדריך של היצרן.
חשוב להתחיל בידוד הכלורופלסט מוקדם בבוקר (או בשלב מוקדם של מחזור האור של חדר הצמיחה) על מנת למנוע הצטברות של עמילן בתוך כלורופלסטים עקב פוטוסינתזה, אשר יכול לעכב את הבידוד של אברונים שלמים. הליך בידוד הכלורופלסט חייב להיעשות במהירות ללא עיכובים מיותרים, ואת כלורופלסטים המבודדים תמיד חייבים להישמר בקירור. זאת על מנת לסייע בהגנה מפני התצפית כי מבודדת כלורופלסטים יאבדו הכדאיות שלהם בהדרגה, וזה לא טוב. אם אתה משתמש מ.ח. מופשר חדש או חיץ HMS, הקפד לערבב למאגר היטב לפני השימוש כדי להשיג פתרון הומוגני. התנאים האופטימליים עבור המגון של חומר צמחי הוקמו באופן אמפירי, והוא יכול להשתנות אם homogenizer רקמות שונה משמש.
אם גנוטיפים צמחים שונים מכילים similaרמות כלורופיל r, כימות כלורופיל יכול לשמש כדרך חלופית לנרמל את דגימות לפני ביצוע מבחני יבוא. הכלורופיל ניתן לקבוע spectrophotometrically הבאים החילוץ של מדגם של כלורופלסטים מבודדים ב -80% (v / v) אצטון מימית 19,20. עם זאת, אם מחירי יבוא הצמחים מראים תוכן כלורופיל שונה (למשל, מוטציות עם פנוטיפים לצהוב) יש להשוות, להשתמש במספר הכלורופלסט לספור לנרמל את דגימות הכלורופלסט ב מבחני היבוא. זה חשוב במיוחד כדי resuspend את כלורופלסטים ביסודיות בשלב 3.11. resuspension מספיק עלול לעזוב אגרגטים של כלורופלסטים, אשר יקשו לספור מספרים במדויק ובכך יפריע את הטעינה הנכונה בתגובות יבוא. אם צבירה חמורה נתפסת מתחת למיקרוסקופ (למשל, אגרגטים עם> 10 הכלורופלסט חברו יחדיו), ממשיך לרעוד המדגם הכלורופלסט על קרח עד aggregates יוסר. קל יותר resuspend את כלורופלסטים בנפח קטן של חיץ.
חשוב להיות מודע לכך תגובות יבואו חלבון (סעיף 5) חייבות להתנהל עם אמצעי זהירות מתאים בגלל האופי רדיואקטיבי שלהם. אמצעי זהירות הנדרש כוללת: לובש כפפות חד פעמיות, בגדי מעבדת משקפי מגן, ניטור decontaminating משטח העבודה וציוד, והשלכה של כל פסולת רדיואקטיבית במכל פסולת מאושרת. כמו כן יש לזכור כי הלחץ האוסמוטי הנכון הוא קריטי לשמירה על תקינות של כלורופלסטים במהלך התגובות יבוא, וזה נשמר בעיקר על ידי חיץ HMS. בגלל 10x HMS הוא צמיג, זה צריך להיות מחומם ראשון RT, ולאחר מכן מעורב באופן יסודי, וכן להחיל באמצעות קצה פיפטה לחתוך כדי להבטיח מדידה של כמויות מדויקות. ב תגובת היבוא, מתיונין קר מתווסף לעכב את ההתאגדות של מתיונין radiolabeled החופשי לתוך chloropl הקשורחלבונים אס באמצעות תרגום organellar במהלך שלב הדגירה, בעוד משמש BSA כדי למזער proteolysis על ידי מתנהג כמו מצע של פרוטאזות.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק PJ מן ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC; להעניק נ"צ BB / K018442 / 1.).
Materials
| Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
| phytoagar | Melford | P1003 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
| triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
| surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
| filter paper | Fisher | FB59023 | |
| Percoll | Fisher | 10607095 | |
| ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
| filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
| 250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
| Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
| Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
| centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
| fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
| fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
| swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
| radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
| rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
| phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
| haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
| cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
| microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
| Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
| gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| methionine | Sigma | M6039 | |
| bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
| glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
| SDS | Fisher | S/5200/53 | |
| Tris Base | Melford | B2005 | |
| dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
| image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |
Referenzen
- Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).
- Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses. Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).
- Ling, Q., Jarvis, P. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants. Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).
- Chua, N. H., Schmidt, G. W. In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits. Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).
- Highfield, P. E., Ellis, R. J. Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase. Nature. 271, 420-424 (1978).
- Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).
- Froehlich, J. Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases. Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).
- Flores-Pérez, &. #. 2. 1. 8. ;., Jarvis, P. Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts. Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).
- Kubis, S., et al. The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins. Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).
- Kubis, S., et al. Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors. Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).
- Aronsson, H., et al. Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency. Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).
- Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane. Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, (1989).
- Aronsson, H., et al. Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves. Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).
- Aronsson, H., Jarvis, R. P. Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays. Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).
- Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma. J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).
- Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants. Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).
- Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts. Plant Cell. 14, 641-654 (2002).
- Miras, S., et al. Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast. J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).
- Nada, A., Soll, J. Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway. J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).
