Retrovirale Transductie van helper T-cellen als een genetische benadering om te studeren mechanismen die hun differentiatie en functie

Alle muis werkzaamheden in deze protocollen werd uitgevoerd overeenkomstig de Dieren Scientific Procedures Act, UK onder het dier Project License 70/6965. 1. retrovirale Productie Vóór procedure alle vereiste goedkeuringen voor het produceren van genetisch gemodificeerde organismen en het gebruik van retrovirussen in zoogdiercellen. Groei van HEK 293T cellen Groeien HEK 293T cellen op 10 cm weefselkweekplaten in HEK 293T medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden / ml penicilline 0,1 mg / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine) . Voor algemene cel passage, split cellen 01:10 bij het bereiken samenvloeiing door het verwijderen van medium en pipetteren de cellen van de plaat met verse HEK 293T medium. LET OP: De cellen moeten samenvloeiing te bereiken in 2-3 dagen. 293T HEK cellen hechten losjes aan de plaat zodat trypsine is niet vereist. 24 uur voorafgaand aan transfectie, split een confluent plaat van cellen 1:10 een 10 cm plaat (één plaat per transfectie) zodat de volgende dag de cellen -50% confluent. Transfectie door calciumfosfaatprecipitatie Ongeveer 1 uur voorafgaande aan transfectie medium verwijderen van cellen en wordt voorzichtig 9 ml vers medium HEK 293T cellen loskomen van de plaat te voorkomen. Bereid 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS 2x) en een verse 2,5 M CaCl 2-oplossing zoals beschreven in Tabel 1. Ontdooi DNA voorraden. Voor de meest efficiënte transfecties gebruikt prep plasmide DNA kwaliteit. In 6 ml met ronde bodem en 15 ml conische buis voeg 5 ug retroviraal DNA (pMIG) 4, 5 ug Helper virus DNA (PCL-Eco) 7 en H 2 O tot 420 pl. Voeg 80 ul van 2,5 M CaCl2 waardoor het uiteindelijke volume op 500 pl. Opmerking: Dit samen met de volgende stap (toevoeging van 2x HBS) kan op regelmatige bank zolang algemene sterile techniek wordt gebruikt. Voeg langzaam 500 ui 2x HBS druppelsgewijs aan bovengenoemde DNA mengsel onder zachtjes wervelen zodat de oplossing continu gemengd en het CaPÛ4 neerslaat zelfs grotere kristallen. Verwijzing naar een weefselkweek kap en voeg langzaam het CaPÛ4 DNA mengsel (1 ml) druppelsgewijs aan het 9 ml medium voor de cellen onder voortdurend en voorzichtig schudden de plaat. Opnieuw wees niet te cellen los te maken van de plaat. Plaats de cellen terug in de incubator. LET OP: Op dit punt zal de capo 4 neerslag gemakkelijk zichtbaar onder een microscoop als kleine kristallen over de grootte van de bacteriën. Deze worden gemakkelijk waargenomen na 30-60 min wanneer de kristallen een kans om naar de bodem van de plaat hebben. Het verzamelen van virus in kweeksupernatanten. De volgende dag (ergens 12-24 uur na transfectie) verwijder het medium en voeden de cellen met 10 mlvers HEK 293T medium opnieuw zorg dat u de cellen niet los van de plaat. LET OP: Deze verdunt uit lymfocyten remmende stoffen die de HEK 293T cellen scheiden in het medium tijdens de transfectie. In de avond van de tweede dag (~ 24 uur na transfectie) voeden cellen met 3,5 ml vers HEK 293T medium. Zorg ervoor dat de plaat in de incubator is dat precies waterpas staat, zodat de ene kant niet droog wordt overgelaten. Verzamel medium ~ 12 uur later (bewaar bij 4 ° C) en voer met 3,5 ml vers medium HEK 293T. Herhalingsbundel 2 keer op ongeveer 12 uur na zodat ongeveer 10 ml medium wordt verzameld. Dit is het virus voorraad. Spinnen achtergebleven HEK 293T cellen en celresten door centrifugeren bij 600 g gedurende 5 min. U kunt ook filteren met een 0,45 pm, lage eiwitbinding, spuit filter. WINKEL virus bij 4 ° C, en voor de beste titers gebruikt binnen een dag of twee, als de titer langzaam afnemen bij 4 ° C. Niet frEEZE, omdat dit de titer aanzienlijk afneemt. 2. Isolatie van Primary naïeve CD4 + T-cellen Isolatie van leukocytcellen Euthanaseren muizen door cervicale dislocatie, CO 2 stikken, of andere humane protocol aangepast aan de regels van de instelling handling dier. Ontleden vers gedood muizen en verwijder de milt en de gewenste lymfeklieren 15. Plaats de organen in putjes van een 6 well weefselkweek plaat met R10 medium (RPMI medium met 10% door warmte geïnactiveerd FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 0,1 mg / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 0,1% β-mercaptoethanol) . Gebruik een celkweek kap voor dissectie van muizen en alle latere manipulaties kans op besmetting in kweken te minimaliseren. LET OP: Houd de R10 medium koude en uit te voeren alle downstream zuivering stappen bij 4 ° C. Plaats een 70 micrometer celkweek zeef in een 50 ml conische buis met ongeveer 5 ml medium R10. Gebruik één zeef voor de milt en lymfeknopen van maximaal drie muizen. Voeg milt en lymfeknopen de cel zeef en macereren met het einde van een 5 ml spuit zuiger. Spoelen met 1-2 ml van R10 medium. Transfer cellen om een ​​15 ml conische buis en breng het volume tot 14 ml met R10. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi supernatant door het gieten van het af met een schone beweging om te voorkomen dat het verstoren van de cel pellet. Voeg 2 ml koude (4 ° C) red cell lysis buffer (tabel 1) aan elke buis. Meng gedurende 3,5 min, het bijhouden van de buis op ijs. OPMERKING: De timing van erytrocyten lysis kritisch dood van lymfocyten voorkomen. Daarom zal de precieze timing van elke partij Red cellysebuffer moeten worden geoptimaliseerd. Voeg ≈12-13 ml R10 medium. Onmiddellijk centrifuge en gooi supernatant als in stap 2.1.5. Voer de wasstappen 2x meer verstandh R10 medium om resten erytrocyten lysisbuffer uit de cellen te verwijderen en de dood van lymfocyten voorkomen. Aantal cellen in een hemocytometer verdunning 1:20 in trypan blauw om de opbrengst van levensvatbare cellen te bepalen. Verwacht ongeveer 8-10 x 10 7 cellen per muis. Isolatie van CD4 + T-cellen via magnetische partikels Kit te verwijderen CD8 + CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC klasse II + en Ter-119 + cellen. Aliquot 8-10 x 10 7 cellen uit stap 2.1.8 per 15 ml conische buis en centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet de bovenstaande vloeistof met een schone beweging om te voorkomen dat het verstoren van de cel pellet. Resuspendeer de cellen in elke buis in 100 pl door hitte geïnactiveerd FBS en voeg 100 ul antilichaam mengsel uit de set. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder voorzichtig mengen op een wals. Terwijl de bovenstaande cellen incuberen, bereid de parels. Resuspendeer kralen in de flacon door vortexen gedurende> 30 sec vervolgens over 1 ml korrels per 8-10 x 10 7 cellen bereid een 15 ml conische buis. Voeg 2 ml van R10 medium per ml van kralen en meng. Plaats de buis in de magneet voor 1 min gooi het supernatant. Verwijder slang van de magneet en resuspendeer kralen in 4 ml medium R10. Deze hoeveelheid korrels is voldoende voor twee incubaties. Was de cellen aan het eind van het antilichaam incubatie (stap 2.2.1) door toevoeging van 10 ml per buis R10 medium. Voorzichtig goed mengen onder zwenken van de buis en centrifugeer cellen bij 600 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet de bovenstaande vloeistof met een schone beweging om te voorkomen dat het verstoren van de cel pellet. Resuspendeer cellen in 1 ml medium R10. Voeg 2 ml van de gewassen korrels uit stap 2.2.2.2 (½ bedrag voor ieder buisje) aan elke buis antilichaam behandelde cellen en incubeer 30 minuten bij 4 ° C onder zachtjes mengen van een roller. Resuspendeer de cel-kraal mengsel door voorzichtig pipetteren 5 maal met een pipet met een smalle tip opening. Vermijd schuimvorming. Plaats de buis in de kralen magneet voor 2 min breng de supernatant dat de negatief geselecteerde cellen naar een nieuwe buis. Houd deze cellen, aangezien zij de CD4 + populatie. Herhaal negatieve selectie nog een keer. Spin cellen uit stap 2.2.5 600 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet het supernatant in stap 2.2.3 en resuspendeer in 1 ml medium R10. Volg de stappen 2.2.4 en 2.2.5 opnieuw. Na de laatste magnetische bolletje selectie, de telling van de cellen om het herstel te bepalen (typische opbrengst 15-20 x 10 6 cellen per 10 8 leukocyten). Isolatie van naïeve CD4 + T-cellen (CD25 – en CD62L hoog) gebruiken Cell Separation Columns Centrifugeer CD4 + T-cellen bij 600 g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer in 150-200 glR10 medium per 10 8 cellen. Voeg 2 pl voorraad gebiotinyleerd CD25 monoklonaal antilichaam (kloon 7D4). Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder voorzichtig mengen op een wals. Was de cellen door toevoeging van 10 ml celscheidingskolom buffer (tabel 1). Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder zoveel supernatant mogelijk en een schatting van de omvang van de buffer / cellen die overblijven. Resuspendeer tot een eindvolume van ongeveer 90 ui per 10 7 cellen. Voeg 20 ul van Streptavidine kralen per 10 7 cellen en meng met zachte flicks. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Terwijl de cellen worden incubatie, bereiden het medium cel scheiding (MS) kolommen voor de handmatige aanpak. Elke kolom MS behoudt 10 7 cellen, en aangezien CD25 + cellen gewoonlijk voor ongeveer 10% van de totale CD4 + cellen gebruikt per kolom 1 10 8 CD4 + T-cellen. Voeg 500 gl celscheidingskolom buffer aan de kolomen laat doorstromen. Herhaal 2 keer. Einde cellen / parel incubatie, wassen cellen door toevoeging van 10 ml celscheidingskolom buffer en centrifugeren bij 600 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in 500 gl celscheidingskolom buffer per 10 8 cellen, maar nog steeds 500 pi als er minder cellen. Toepassen 500 gl cellen / kralensuspensie aan de kolom en verzamel de doorstroom. Geef deze over de kolom nog 1 keer en het verzamelen van de stroom door nogmaals. Spoel de kolom 3 maal met 500 pi celscheidingskolom buffer, toevoegen van elk van deze stromen door spoelingen van de verzamelde cellen. Dit zijn de CD25 – cellen. Tellen cellen om de opbrengst te bepalen. Als Tregs (CD25 + cellen) gewenst, te isoleren als volgt. Verwijder de kolom uit de afscheider en houd deze boven een open universele buis en zorg ervoor dat de steriliteit te behouden. Snel pipet 500 pi buffer celscheiding op de colUMN en stevig spoelen van de positieve fractie, met behulp van de met de kolom geleverd zuiger. Herhaal de spoelprocedure nog 2 keer. Passeer de positieve fractie over een verse kolom cel scheiding MS en gooi deze flow-through. Stevig spoelen van de positieve cellen drie keer wanneer voor en centrifugeer cellen bij 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C Resuspendeer cellen in 1 ml medium en R10 tellen om de opbrengst te bepalen. CD62L hoge T cellen gecentrifugeerd CD25 – – T-cellen die hierboven in stap 2.3.6 bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° en resuspendeer in 150-200 pi R10 medium per 10 7 cellen CD25 verkrijgen. Voeg 5 ul leverbaar CD62L gebiotinyleerd monoklonaal antilichaam (kloon MEL-14) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C onder voorzichtig mengen op een wals als voorheen. Voer wassen, Streptavidine kraal binding, en de voorbereiding celscheidingskolom zoals beschreven voor Treg isolatie protocol (2.3.7). Deze keer gebruikde kolom grote celscheiding (LS) met een capaciteit van 10 8 cellen heeft. Sinds CD62L high T-cellen typisch vertegenwoordigen ongeveer 60-70% van de CD25 – cellen, gebruik 1 LS celscheidingskolom per 10 8 cellen. Voeg cel / bead mengsel LS celscheidingskolom zie stap 2.3.6 – ditmaal Werp het laatste kolom doorstroom en spoelt. Verzamel de CD62L high T-cellen, zoals beschreven in stap 2.3.7 voor de CD25 + cellen collectie. Centrifugeer cellen bij 600 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C Resuspendeer cellen in 1 ml R10 en tel de opbrengst te bepalen. Verdun tot 0,75-1 X10 6 cellen per ml in medium R10. Analyseer zuiverheid van de cellen door Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). FACS kleuring strategie Voor cellen pre en post alle stadia van isolement, vlek met CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (helper en cytotoxische T-cellen), en MHCII-PE (MHC klasse II tot expressie brengen). Voor cellen voor en na CD25 isolatie, vlek met CD4-FITC en CD25-PE (Tregs ten opzichte van andere helper T-cellen). Voor cellen voor en na CD62L isolatie vlek met CD4-FITC, CD62L-PE en CD44-APC (naïeve versus geheugen en effector helper T-cellen). Voor elke analyse plaats 10 5 cellen in een put van een 96 well U-bodemplaat. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het medium en was de cellen eenmaal met 200 pi DPBS. Centrifuge zoals hierboven en giet DPBS. Voeg 50 ul per putje DPBS en 0,5 pi van elk antilichaam (zoals in 2.4.1) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker te bleken fluorescentie merkteken voorkomen. Was de cellen 2x met DPBS als in 2.4.2 en onmiddellijk te analyseren op een flowcytometer met behulp van protocollen en richtlijnen die specifiek zijn voor het instrument bij de hand. NB: Na de laatste isolatie stap van een goede voorbereiding, 90-95% van de cellenzijn CD4 + CD25 – CD62L hoge T-cellen. 3. Retrovirale transductie van geactiveerde CD4 + T-cellen en hun differentiatie in specifieke T-helper-subsets retrovirale Transductie OPMERKING: Retrovirale integratie en expressie van genen vereist celdeling. Daarom moeten T-cellen worden geactiveerd O / N. Terwijl het isoleren van de naïeve T-cellen, jas een 24 well weefselkweek plaat met anti-CD3 en anti-CD28-antilichamen verdund in DPBS. Voeg 250 ul per putje. Gebruik anti anti-CD3 bij 1 ug / ml. Met anti-CD28 bij 2 ug / ml, als cellen uiteindelijk zullen worden onderscheiden onder Th0, Th1, Th2 en iTregs omstandigheden. Met anti-CD28 bij 10 ug / ml voor Th9 en Th17 omstandigheden. Incubeer 2 uur bij ~ 37 ° C in een weefselkweek incubator. Vlak voor het kweken van de cellen, verwijder de antilichaam-oplossing en was de plaat met ~ 250 ul van DPBS per goed op unbou verwijderennd antilichaam. Wees voorzichtig niet te laten de plaat uitdrogen, zodat het verwerken van een maximum van 6 wells tegelijk. Verwijderen DPBS wassen en voeg 1 ml van naïeve CD4 + T-cellen in R10 medium bij 0,75-1 x 10 6 cellen per ml. Cellen te activeren O / N (14-16 uur). De volgende dag, centrifuge cellen in de plaat bij 900 xg gedurende 5 minuten bij 30 ° C om de cellen hechten aan de bodem van de putjes. Verzamelen en opslaan van de medium zorg dat u de cellen niet te verdringen en te vervangen door 1 ml virus kweeksupernatant bereid van het virus productie protocol. Laat de cellen uitdrogen, zodat het verwerken van een maximum van 4 wells tegelijk. Aan elk putje voeg 1 pl van 8 mg / ml polybreen en 10 gl 1 M HEPES pH 7,5 virus opname bevorderen en significante alkalisering in de omgeving CO 2 in de daaropvolgende centrifugatie voorkomen. Centrifugeer cellen in plaat bij 900 xg gedurende 90 min bij 30 ° C Differentiatie van cellen in Specific subsets Haal het virus kweeksupernatant en vervangen door 1 ml van het medium boven in fase 3.1.4 door, aangezien IL-2 en andere T-cel groeifactoren. reagentia aangegeven in Tabel 2 en kweekcellen 3-4 dagen om cellen differentiëren tot specifieke subsets voegen. Analyse van Cellen Voor intracellulaire kleuring van cytokinen behandelen cellen met 1 ug / ml van zowel Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en ionomycine gedurende 4 uur. Gedurende de laatste 2 uur van de stimulatie, voeg 1 ug / ml Brefeldine A. Resuspendeer cellen van de bodem van elk putje op en neer te pipetteren meerdere malen. Breng circa 10 5 cellen om een 96 putjes U bodemplaat (meestal 100 pl van de 1 ml van de cultuur van de Th-cellen) voor fixatie en kleuring. Voor GFP kleuring vast cellen met 100 pi 2% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende precies 5 min, een langere incubatietijd verbleekt het GFP eennd interfereren met Foxp3 kleuring. Was de cellen door toevoeging van 100 gl DPBS aan elk putje en centrifugeer bij 600 xg bij 22 ° C gedurende 5 minuten. Giet het supernatant. Let op: Paraformaldehyde is giftig. Omgaan in een zuurkast met de huid en oogbescherming. Fixeer de cellen opnieuw met 100 ul 1x Fixation buffer gemaakt van de Foxp3 kleuring kit (1 volume van Fixation buffer tot 3 volumes verdunningsmiddel). Incubeer de cellen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur of als alternatief incuberen bij 4 ° C gedurende 16 uur. Na fixatie doorlaatbaar cellen door toevoeging van 100 pi permeabilisatie buffer van dezelfde kit. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-45 minuten en centrifugeer bij 600 xg bij 22 ° C gedurende 5 minuten. Voor antilichaam kleuring, verwijder fixatie / permeabilisatie buffer en voeg 50 ul van verse permeabilisatie buffer. Voeg de vereiste antilichaam verdund in permeabilisatie buffer bij 0,5 ul per 50 ul buffer per monster. Incubeer 30-45 minuten bij kamertemperatuur in het donker naar het bleken van de griep te voorkomenorescent label. Voeg 150 ul permeabilisatie buffer en centrifugeer bij 600 xg bij 22 ° C gedurende 5 minuten. Gooi de permeabilisatie buffer en voeg 200 ul DPBS. Analyseren op een flowcytometer met behulp van protocollen en richtlijnen die specifiek zijn voor het instrument bij de hand. LET OP: Zorg ervoor dat u de juiste knoppen voor cytokine kleuring omvatten, zoals kleuring met isotype controle antilichamen, het analyseren van niet-geactiveerde of Th0 geactiveerde cellen, etc.