כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
קבוצת תיבת 1 ניידות גבוהה (HMGB1) חלבון הוא חלבון אדריכלי הלא היסטון כי הוא מעורב בויסות תפקידים חשובים רבים בגנום, כגון שעתוק, שכפול הדנ"א, ותיקון דנ"א. HMGB1 נקשר מעוות מבחינה מבנית DNA עם זיקה חזקה יותר מאשר ב-דנ"א הקנונית. לדוגמה, מצאנו כי HMGB1 נקשר ל- DNA interstrand crosslinks (ICLs), אשר קוולנטית לקשר בין שני גדילי הדנ"א, לגרום לעיוות של הסליל, וכל עוד יוסיפו מתוקנות יכול לגרום מוות של תאים. בשל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, כמה סוכנים וישכנע כיל משמשים כיום תרופות כימותרפיות במרפאה. בעוד יוצרי כיל סוכנים להראות העדפות עבור רצפים בסיס מסוים (למשל, 5'-TA-3 "הוא האתר crosslinking המועדף psoralen), הם בעיקר לגרום נזק לדנ"א באופן בלתי מבוקר. עם זאת, על ידי קוולנטית צימוד הסוכן וישכנע כיל על oligonucleotide יוצרי טריפלקס (TFO), אשר נקשר ל- DNA בתוך ספציפי ברצףבאופן, נזק לדנ"א ממוקד יכולה להיות מושגת. כאן, אנו משתמשים TFO מצומדות קוולנטית על 'קץ 4'-hydroxymethyl-4,5' 5, 8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen ליצור כיל אתר ספציפי על פלסמיד מוטציה-הכתב להשתמש ככלי ללמוד את שינוי, עיבוד, ותיקון אדריכלי של נגעים DNA מורכב על ידי HMGB1 בתאים אנושיים. אנו מתארים טכניקות ניסוי להכין ICLs TFO-מכוון על פלסמידים כתב, וכדי לחקור את הקשר בין HMGB1 עם ICLs המכוונת TFO בהקשר הסלולר באמצעות מבחני immunoprecipitation הכרומטין. בנוסף, אנו מתארים מבחני supercoiling DNA להעריך שינוי אדריכלי מסוים של דנ"א פגום על ידי מדידת כמות פניות superhelical הציג על פלסמיד psoralen-crosslinked ידי HMGB1. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לחקור את התפקידים של חלבונים אחרים המעורבים בעיבוד ותיקון ICLs TFO מכוונת או נזק לדנ"א ממוקדים אחרים בכל שורת תאים של עניין.
Introduction
טריפלקס יוצרי oligonucleotides (TFOs) לאגד דופלקס DNA בצורה רצף ספציפי באמצעות מליטה מימן Hoogsteen ליצירת מבנים משולשת הסליל 1-5. הטכנולוגיה טריפלקס נעשה שימוש כדי לחקור מגוון של מנגנונים biomolecular, כגון שעתוק, תיקון נזק DNA, גן מיקוד (הנסקרת ב אזכור 6-8). TFOs נעשה שימוש נרחב כדי לגרום נזק לאתר ספציפי על פלסמידים כתב 9,10. המעבדה שלנו ואחרים השתמשו בעבר TFO, AG30, קשור מולקולה psoralen לגרום crosslinks interstrand DNA ספציפיים לאתר (ICLs) בגן supF על פלסמיד pSupFG1 5,10-12. ICLs הם ציטוטוקסיים מאוד כשהפצעים קוולנטית crosslink שני גדילי דנ"א, וכל עוד יוסיף מתוקן, יכול לחסום שעתוק גנים ומסכל מכונות שכפול הדנ"א 13,14. בגלל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, סוכנים וישכנע כיל שימשו תרופות כימותרפיות לטיפולשל סרטן ומחלות אחרות 15. עם זאת, העיבוד ותיקון ICLs בתאים אנושיים אינו מובן היטב. לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בעיבוד של ICLs בתאים אנושיים עשוי לעזור לשפר את היעילות של משטרי כימותרפיות מבוססי כיל. TFO-induced ICLs ביניים תיקון שלהם יש פוטנציאל לגרום לעיוותים מבניים משמעותיים סליל הדנ"א. עיוותים כאלה הן מטרות סבירות עבור חלבונים אדריכליים, אשר נקשרים ל- DNA המעוותת עם זיקה חזקה יותר מאשר ה- DNA דופלקס B-צורה הקנונית 16-20. הנה, למדנו את שיוכה של חלבון אדריכלי בהיקף הנרחב ביותר, HMGB1 עם ICLs בתאים אנושיים באמצעות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) מבחנים על פלסמידים-crosslinked psoralen וזיהיתי לחיקוי עבור HMGB1 בויסות את הטופולוגיה של DNA פלסמיד-crosslinked psoralen ב אנושי lysates תאים סרטניים.
HMGB1 הוא שופע מאוד בכל מקום בגוף לידי ביטוי שאינו שלוהטון חלבון אדריכלי הנקשרת דנ"א פגום מצעים DNA מובנים לחילופין עם זיקה חזקה יותר מאשר DNA B-הצורה הקנונית 17-20. HMGB1 מעורב בתהליכים מטבוליים כמה DNA, כגון שעתוק, שכפול הדנ"א, תיקון דנ"א 16,21-23. אנחנו הוכחנו בעבר כי HMGB1 נקשר TFO המכוונת ICLs במבחנה עם זיקה גבוהה 20. יתר על כן, אנו הוכחנו כי חוסר HMGB1 הגדיל את עיבוד מוטגנים של ICLs TFO-ביים HMGB1 מזוהה תיקון כריתת נוקלאוטיד (NER) שיתוף גורם 23,24. לאחרונה, מצאנו כי HMGB1 קשור TFO המכוונת ICLs בתאים אנושיים והגיוס שלה נגעים כאלה תלוי חלבון NER, XPA 16. Supercoiling השלילי של DNA הוכח לקדם את ההסרה היעילה של נגעי DNA על ידי נר 25, ומצאנו כי HMGB1 גורם supercoiling השלילי מועדף על יציקה המכילה כיל מכוון TFOמצעים באמצע (יחסית מצעים פלסמידים שאינם פגומים) 16, מתן הבנה טובה יותר של פוטנציאל התפקיד (ים) של HMGB1 בתור גורם שיתוף NER. העיבוד של ICLs לא מובן לחלוטין בתאים אנושיים; וכך, טכניקות המבחנים שהפותחים מבוססות על הכלים המולקולריים המתוארים כאן יכולים להביא לזיהויו של חלבונים נוספים המעורבים תיקון כיל, אשר בתורו עשוי לשמש מטרות תרופתיות כפי שאפשר לנצל כדי לשפר את היעילות של כימותרפיה לסרטן.
הנה, גישה יעילה כדי להעריך את היעילות של היווצרות כיל TFO מכוונת ב- DNA פלסמיד על ידי denaturing ג'ל אלקטרופורזה agarose נדונה. יתר על כן, באמצעות פלסמידים המכילים את ICLs TFO-המכוון, טכניקות כדי לקבוע את הקשר של HMGB1 עם פלסמידים פגועים כיל בהקשר הסלולר באמצעות מבחני שבב שונים תואר. בנוסף, שיטה קלילה ללמוד שינויי טופולוגי הציגו ידי הדואר אדריכלי חלבון HMGB1, במיוחד על מצעים פלסמיד פגועי כיל lysates התא האנושי נקבע על ידי ביצוע מבחני supercoiling באמצעות דו מימדי ג'ל אלקטרופורזה agarose. הטכניקות המתוארות ניתן להשתמש כדי לקדם את ההבנה של המעורבות של תיקון דנ"א וחלבונים אדריכליים בעיבוד של ניזק לדנ"א ממוקד על פלסמידים בתאים אנושיים.
אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים להקמת ICLs psoralen אתר ספציפי TFO-מכוון על פלסמיד דנ"א, וצ'יפ פלסמיד עתידי supercoiling מבחני לזהות חלבונים מקשרים עם הנגעים, וחלבונים אשר משנים את הטופולוגיה DNA, בהתאמה. מבחנים אלה יכולים להיות שונים כדי לבצע עם סוכנים מזיקים אחרים לדנ"א, TFOs, מצעים פלסמיד, שורות תאים יונקות עניין. למעשה, הראינו כי יש לפחות פוטנציאל אחד זיקה ייחודית גבוהה TFO מחייב אתר בתוך מכל גן מבואר בגנום האנושי 26. אֵיךפעם, לבהירות תיארנו טכניקות אלה לשימושם של psoralen מצומדות TFO ספציפיים (pAG30) על פלסמיד מוטציה-עיתונאי ספציפי (pSupFG1) בתאים אנושיים U2OS כפי שכבר מנוצל מוקהרג'י & ואסקז 2016 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההיווצרות היעילה של ICLs TFO המכוונת תלויה בשני גורמים מכריעים: ראשית, רכיבי חיץ נכון (למשל, MgCl 2) וזמן דגירה של TFO עם מצע DNA היעד שלה (תלוי הזיקה המחייבת של TFO למטרתה דופלקס, ועל ריכוזי בשימוש); ושנית, את המינון הנכון של UVA (365 ננומטר) הקרנה לגבש crosslinks psoralen ביעילות. הי…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדה ואסקז לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים מכון הסרטן בריאות / לאומי [CA097175, CA093279 כדי KMV]; ואת מניעת סרטן מכון המחקר של טקסס [RP101501]. מימון תשלום גישה פתוחה: מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לסרטן [CA093279 כדי KMV].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
Referenzen
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
- Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
- Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
- Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
- Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
- Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
- Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
- Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
- Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
- Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
- Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
- Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
- Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer – a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
- Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
- Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
- Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemie. 42, 2664-2671 (2003).
- Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemie. 44, 4188-4195 (2005).
- Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
- Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
- Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
- Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
- Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
- Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
- Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemie. 28, 5658-5664 (1989).
- Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
- Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
- Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
- Puri, N., et al. Minimum number of 2′-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemie. 41, 7716-7724 (2002).
- Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
- Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).
