मानव प्राथमिक सेल संस्कृतियों में circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन के स्राव के समानांतर मापन
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
Circadian घड़ियों दैनिक पर्यावरण परिवर्तन की आशंका से बाहरी दुनिया के लिए एक अनुकूलन के लिए अनुमति देता है सब प्रकाश के प्रति संवेदनशील जीवों में कार्य कर रहे हैं। circadian घड़ी और शरीर विज्ञान की सबसे पहलुओं के बीच तंग कनेक्शन के बारे में हमारी समझ में काफी प्रगति पिछले एक दशक से अधिक के क्षेत्र में किया गया है। हालांकि, आणविक आधार मानव में circadian थरथरानवाला के समारोह underlies कि unraveling उच्चतम तकनीकी चुनौती का रहता है। यहाँ, हम लंबी अवधि (2-5 दिन) bioluminescence रिकॉर्डिंग और बहिर्वाह मध्यम संग्रह सुसंस्कृत मानव प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। इस प्रयोजन के लिए, हम एक lentiviral luciferase संवाददाता है कि एक कोर घड़ी जीन प्रमोटर, जो हार्मोन के स्राव और circadian bioluminescence की समानांतर मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है के नियंत्रण के अधीन साथ प्राथमिक कोशिकाओं transduced है। इसके अलावा, हम जनसंपर्क में circadian घड़ी में खलल न डालें के लिए परिस्थितियों का वर्णनsiRNA को निशाना घड़ी परासंक्रमित द्वारा imary मानव कोशिकाओं। मानव अग्नाशय टापू द्वारा इंसुलिन के स्राव के circadian नियमन पर हमारे परिणाम है, और मानव कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं द्वारा myokine स्राव, इस पद्धति के आवेदन को वर्णन करने के लिए यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं। ये सेटिंग्स मानव परिधीय घड़ियों के आणविक मेकअप का अध्ययन करने और शारीरिक या pathophysiological शर्तों के तहत प्राथमिक कोशिकाओं पर उनके कार्यात्मक प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
Circadian समय प्रणाली (लैटिन "लगभग दिन" से), सभी प्रकाश के प्रति संवेदनशील जीवों में उभरा है पृथ्वी के घूर्णन करने के लिए एक अनुकूली तंत्र के रूप में। स्तनधारियों में, यह एक श्रेणीबद्ध तरीके से आयोजित किया जाता है, उदर हाइपोथेलेमस की suprachiasmatic नाभिक में स्थित है जो केंद्रीय घड़ी, शामिल है, और परिधीय (या गुलाम) oscillators कि विभिन्न अंगों में ऑपरेटिव कर रहे हैं। इसके अलावा, इन सेल स्वायत्त आत्मनिर्भर oscillators शरीर 1 के लगभग हर कोशिका में कार्य कर रहे हैं। रोशनी का संकेत है, SCN न्यूरॉन्स के लिए एक प्रमुख तुल्यकालन क्यू (Zeitgeber) का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि SCN से चलाई तंत्रिका और त्रिदोषन संकेतों परिधीय घड़ियां रीसेट। इसके अलावा बाकी गतिविधि लय, कि बारी खिला-उपवास के चक्र में ड्राइव में, परिधीय घड़ियां 2 के लिए आगे synchronizers हैं। हमारी वर्तमान समझ के मुताबिक, कोर घड़ी की आणविक मेकअप ट्रांसक्रिप्शनल और transla पर आधारित हैराष्ट्रीय प्रतिक्रिया छोरों, जो जीवों के बीच संरक्षित कर रहे हैं। इस ट्रांसक्रिप्शनल activators BMAL1 और घड़ी है, जो एक साथ नकारात्मक कोर घड़ी प्रति और रोना जीन का प्रतिलेखन सक्रिय शामिल हैं। प्रति और रोना प्रोटीन का उच्च स्तर BMAL1 / घड़ी परिसर के निषेध के माध्यम से अपने खुद के प्रतिलेखन को बाधित करेगा। एक सहायक पाश परमाणु रिसेप्टर्स REV-erbs और RORs है, जो भी BMAL1 और घड़ी के प्रतिलेखन विनियमित होते हैं। इसके अलावा, फोस्फोराइलेशन, sumoylation, एसिटिलीकरण, हे-GlcNAcylation, क्षरण और कोर घड़ी प्रोटीन के परमाणु प्रविष्टि सहित posttranslational घटनाओं 24 घंटा दोलन चक्र 3 स्थापित करने में एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण नियामक परत का प्रतिनिधित्व करते हैं।
जमते सबूत कृंतक मॉडल में अध्ययन से उपजा है और चयापचय और अंत: स्रावी कार्यों 4-5 के समन्वय में circadian प्रणाली की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला गया। larg के एक नंबरई-पैमाने transcriptome विश्लेषण का सुझाव है कि खिला – उपवास चक्र परिधीय oscillators 6-8 के तुल्यकालन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। इन अध्ययनों के साथ एक समझौते में, मूषक और मनुष्यों में metabolomic और lipidomic विश्लेषण से पता चला है कि चयापचयों की एक बड़ी संख्या में एक circadian ढंग 9-11 में ऊतक, प्लाज्मा, और लार में हिलाना। महत्वपूर्ण बात है, सबसे हार्मोन रक्त 5,12-13 में circadian लय दिखा रहे हैं। इसके अलावा, इसी परिधीय ऊतक का निर्माण हार्मोन के circadian घड़ियों स्थानीय स्तर पर हार्मोन के स्राव को विनियमित सकता है। सेल स्वायत्त circadian oscillators कृंतक और मानव अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं 14-16 में वर्णित किया गया है। ये oscillators अग्नाशय आइलेट transcriptome विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और 15,17-18 कार्य करते हैं। इसके अलावा, मानव कंकाल myotubes द्वारा myokine स्राव हाल ही में एक circadian पैटर्न है, जो सेल स्वायत्त oscillato द्वारा विनियमित है प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन किया गया हैइन कोशिकाओं को 19 में ऑपरेटिव रु।
विवो में मानव में circadian लय के अध्ययन के लिए कई दृष्टिकोण व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, प्लाज्मा मेलाटोनिन या कोर्टिसोल के स्तर के साथ ही वक्ष त्वचा की सतह के तापमान (संदर्भ 3,20 में समीक्षा) अंतर्जात circadian घड़ियों का आकलन करने के लिए अध्ययन किया गया है। हालांकि इन तरीकों विवो में प्रणालीगत circadian दोलनों का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं, वे विभिन्न अंगों और ऊतकों में मुक्त चल स्वायत्त circadian लय का एक विश्वसनीय आकलन उपलब्ध कराने से दूर हैं। फिर भी, प्रणालीगत विनियमन से इस तरह के विच्छेदन इन कोशिकाओं के समारोह पर intracellular आणविक घड़ियों के विशिष्ट प्रभाव को समझने के लिए एक अनिवार्य उपकरण हो सकता है। इसलिए, अमर या प्राथमिक सुसंस्कृत इन विट्रो में सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं में मानव घड़ियों के अध्ययन के लिए विश्वसनीय तरीकों को विकसित करने के लिए एक पर्याप्त प्रयास शुरू किया गया है। महत्वपूर्ण बात है, यह दिखा दिया है किघड़ी सुसंस्कृत प्राथमिक त्वचा fibroblast कोशिकाओं में मापा विशेषताओं बारीकी से पूरे जीव 21 के व्यक्तिगत घड़ी गुण दर्शाते हैं। फ्लोरोसेंट और bioluminescent circadian संवाददाताओं के विकास के बहुत इस दृष्टिकोण 22-27 उन्नत है। इसके अलावा, अध्ययन प्राथमिक सेल घड़ियों है कि अलग अलग परिधीय अंगों से निकाली गई है मानव ऊतक विशेष घड़ियों 3,5,16,19-20,28 की आणविक संपत्तियों की जांच के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, इन विट्रो सिंक्रनाइज़ प्राथमिक explants या कोशिकाओं में circadian घड़ियों के मूल्यांकन, bioluminescent संवाददाताओं का उपयोग करके, मानव परिधीय घड़ियों के आणविक मेकअप और अंग समारोह पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक बेहद उपयोगी विधि का प्रतिनिधित्व करता है।
इस अनुच्छेद में, हम स्वायत्त सेलुलर घड़ी के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से इन विट्रो में सिंक्रनाइज़ मानव प्राथमिक आइलेट और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में circadian जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करेंगेइन कोशिकाओं के स्रावी समारोह पर व्यवधान।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रयोगात्मक यहाँ वर्णित सेटिंग्स, सुसंस्कृत मानव प्राथमिक कोशिकाओं में circadian bioluminescence पत्रकारों के lentiviral वितरण से बना रहे हैं बाद में इन विट्रो तुल्यकालन और कई दिनों के लिए bioluminescence की सतत रिकॉर्डिंग, और ए?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जिनेवा विश्वविद्यालय से हमारे सहयोगियों के लिए आभारी हैं: इस काम पर रचनात्मक टिप्पणियों के लिए जैक्स फिलिप, Ueli Schibler perifusion प्रणाली के विकास के साथ और वैज्ञानिक प्रेरणा के लिए अमूल्य मदद के लिए, के लिए कल्पना होने के डिजाइन, निर्माण और के कमीशन आन्द्रे Liani छिड़काव प्रणाली, perifusion प्रणाली और ड्रिप-biolumicorder सॉफ्टवेयर के विकास में सहायता के लिए Lesa-टेक्नोलॉजी लिमिटेड कंपनी, जॉर्ज Severi perifusion प्रयोगों के साथ सहायता के लिए, उर्सुला Loizides-मैनगोल्ड के लिए गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने, और lentivirus की तैयारी के लिए ऐनी-Marie Makhlouf ; एटीन Lefai, स्टेफ़नी Chanon और मानव प्राथमिक myoblasts की तैयारी के लिए हुबर्ट विडाल (INSERM, लियॉन) के लिए; और मानव टापू प्रदान करने के लिए डोमेनिको बॉस्को और थियरी Berney (मानव आइलेट ट्रांसप्लांटेशन Center, जिनेवा विश्वविद्यालय अस्पताल) के लिए। यह काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान सं द्वारा वित्त पोषित किया गया 31003A_146475 / 1, सीnergia स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान सं CRSII3-154405, Fondation Romande डालना ला Recherche सुर Diabete, बो Hjelt फाउंडेशन, Fondation अर्न्स्ट एट लूसी Schmidheiny, और सोसाइटी Académique de Genève (सीडी)।
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
Referenzen
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