Lipider er kjent for å spille en viktig rolle i cellulære funksjoner. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å bestemme lipid sammensetningen av neutrofiler, med vekt på kolesterolnivået, ved å bruke både HPTLC og HPLC for å få en bedre forståelse av de underliggende mekanismene for nøytrofil ekstracellulær felle dannelse.
Lipid analyser utført ved høy-ytelses tynnsjiktkromatografi (HPTLC) er en forholdsvis enkel, kostnadseffektiv metode for å analysere et bredt spekter av lipider. Funksjonen av lipider (for eksempel i vert-patogen interaksjoner eller vert inngang) er blitt rapportert å spille en avgjørende rolle i cellulære prosesser. Her viser vi en fremgangsmåte for å bestemme lipid sammensetning, med en vekt på kolesterolnivået av primære blodavledede nøytrofiler, ved HPTLC i sammenligning med høy ytelse væskekromatografi (HPLC). Formålet var å undersøke rollen til lipid / kolesterol endringer i dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (garn). NET frigivelse er kjent som en vertsforsvarsmekanisme for å hindre patogener i å spre seg inne i verten. Derfor, blodavledede humane neutrofiler ble behandlet med metyl-β-cyklodekstrin (MβCD) for å indusere lipid forandringer i cellene. Ved hjelp av HPTLC og HPLC, har vi vist at MβCD behandling av cellene fører til lipidforandringer assosiert med en signifikant reduksjon i kolesterol-innholdet i cellen. På samme tid, MβCD behandling av de nøytrofile celler førte til dannelse av garn, som vist ved immunofluorescens-mikroskopi. I sammendraget, her presenterer vi en detaljert metode for å studere lipid endringer i nøytrofile granulocytter og dannelsen av Nets.
Lipider har vist seg å spille en viktig rolle i celle homeostase, celledød, host-patogen interaksjoner, og cytokin frigjørings en. Over tid har interesse for og kunnskap om virkningen av lipider i host-patogen interaksjoner eller betennelse økt, og flere publikasjoner bekrefter den sentrale rollen av visse lipider, spesielt steroid kolesterol, i cellulære responser. Farmakologisk behandling med statiner, som brukes som inhibitorer av kolesterolbiosyntese ved blokkering av 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym-A-reduktase (HMG-CoA-reduktase), kan fungere som anti-inflammatoriske midler ved å senke serumnivået av interleukin 6 og C-reaktivt protein 2. Kolesterol- og Glycosfingolipid anriket strukturer kan brukes av flere patogener, slik som bakterier og virus, som en inngangsport til verten 3, 4, 5,class = "ekstern referanse"> 6. Sfingolipider (f.eks, sfingomyelin) er blitt vist å bli brukt av patogener for å fremme deres patogenitet 7. I makrofager, mykobakterier bruk kolesterolanriket domener for å komme inn i cellen; en reduksjon av kolesterol hemmer mycobakteriell opptak 8. Videre infeksjon av makrofager med Francisella tularensis, en zoonotisk middel ansvarlig for tularemia (også kjent som kanin feber) 9, førte til en infeksjon som ble opphevet når kolesterol ble uttømt fra membranene 10. På lignende måte ble det invasjon av vertsceller med Escherichia coli via fettrike konstruksjoner vist seg å være kolesterol-avhengige 4. Dessuten, Salmonella typhimurium smitteforsøk av epitelceller viste at kolesterol er avgjørende for patogen adgang inn i cellene 11. Kolesterol uttømming inhibited opptaket av Salmonella 11. Videre en fersk undersøkelse utført av Gilk et al. viste at cholesterol spiller en viktig rolle i opptaket av Coxiella burnetti 12. I tillegg Tuong et al. funnet at 25-Hydroxycholesterol spiller en avgjørende rolle i fagocytose av lipopolysakkarid (LPS) -stimulerte makrofager 13. Fagocytose ble redusert når makrofager ble farmakologisk behandlet for å utarme kolesterol 14. Således, kolesterol og andre lipider synes å spille en viktig rolle i inflammasjon og infeksjon, siden deres utarming kan redusere risikoen for invasjon fra flere patogener 10, 11, 12.
Nylig var vi i stand til å vise at Lipidendringer, spesielt uttømming av kolesterol fra celle, indusere dannelsen av nøytrofil extracellular feller (garn) i humane, blodavledede nøytrofiler 15. Siden oppdagelsen av garn i 2004, har de vist seg å spille viktige roller i bakterie entrapment, og dermed i å hindre spredning av smitte 16, 17. NET består av en DNA-ryggrad forbundet med histoner, proteaser, og antimikrobielle peptider 16. Frigjøringen av garnene med nøytrofiler kan induseres av invaderende patogener 18, 19 og kjemiske substanser som forbol-myristat-acetat (PMA) eller statiner 16, 20. Men de detaljerte cellulære mekanismene, og spesielt den rollen av lipider i denne prosessen, er fortsatt ikke helt klart. Analysen av lipider kan føre til en bedre forståelse av de som er involvert i en rekke forskjellige cellulære prosesser og interaksjoner, for eksempel frigjøring av NET mekanismer. Cholesterol og sfingomyelin er viktige bestanddeler i cellemembranen og lipid mikrodomener, hvor de legger stabilitet og lette gruppering av de som er involvert i proteinhandel og signaleringshendelser 21 proteiner. For å undersøke den mekanistiske rolle av visse lipider, amfifile farmakologiske midler, så som cyklisk oligosakkarid metyl-β-cyklodekstrin (MβCD), kan brukes til å endre den lipidsammensetningen av en celle og for å redusere kolesterol in vitro 15. Her presenterer vi en metode for å bruke HPTLC for å analysere den lipidsammensetningen av nøytrofiler som respons på MβCD. HPLC ble brukt til å bekrefte nivået av kolesterol i nøytrofile befolkningen. Videre beskriver vi en fremgangsmåte for å visualisere dannelsen av nett ved immunofluorescens-mikroskopi i humane, blodavledede nøytrofiler som respons på MβCD.
Metodene som beskrives her, kan brukes til å analysere bestemte lipider, så som kolesterol, ved HPTLC eller HPLC, og for å undersøke effektene av farmakologiske Lipidendringer på dannelsen av NET (se Neumann et al. 15).
HPTLC er et forholdsvis kostnadseffektiv og enkel metode for å analysere et bredt spekter av lipider i et stort antall prøver. Denne metoden har vært brukt i mange forsknings- områder, inkludert antibiotika kvantifisering <sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et fellesskap av Akademie für Tiergesundheit (AFT) og et fellesskap fra PhD-programmet, "Animal og Zoonotiske infeksjoner," ved University of Veterinary Medicine, Hannover, Tyskland, gitt til Ariane Neumann.
Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
Excel | Microsoft | 2010 | |
DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Light microscope | VWR | 630-1554 | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lipid isolation and analysis | |||
1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |