Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln

Umweltbelastungen, insbesondere diejenigen der Nanopartikel (NP) Bereich (1 – 20 nm Durchmesser), haben aufgrund der Fähigkeit zur Fettleibigkeit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden ^1-3 die Blut – Hirn – Schranke zu überwinden. Erhöhte Exposition gegenüber Verschmutzung kann eine Entzündung im zentralen Nervensystem, den Hypothalamus ¹ induzieren. Ein potentieller Mechanismus , bei dem dies geschieht , durch Nanopartikel induzierte Aktivierung von Mikroglia (brain Immunzellen) ⁴ sein könnte. Frühere Studien haben in – vivo – Modellen verwendet , um die Auswirkungen von Nanopartikeln auf die Gesundheit des Gehirns zu untersuchen , die zeitaufwendig, teuer, und antworten Sie nicht direkt auf die Frage, wie NPs Mikroglia beeinflussen. Mikroglia spielen eine facettenreiche Rolle im zentralen Nervensystem, einschließlich der Wartung des Gehirns Mikroumgebung und die Kommunikation mit Neuronen über die Freisetzung von sekretierten Faktoren und Zytokine umgibt. In Abhängigkeit von den Stimuli können Mikroglia zu einem M1 pr aktivierbaro-entzündliche oder M2 anti-inflammatorische Zustand. Beispielsweise Aktiv M1 lösen Mikroglia proinflammatorische Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α), während M2 Mikroglia Freisetzung anti-inflammatorische Zytokine einschließlich Interleukin-4 (IL-4) aktiviert. Um unsere Leihmutter in – vitro – Biosensor zur Bestimmung von Neurotoxizität von Luftschadstoffen zu validieren, wir gemessen Mikroglia Reaktion auf 20 nm Silber – Nanopartikel (AGNPS). Das Ziel dieses Artikels ist es zu beschreiben , wie ein in – vitro – Mikroglia – Zelllinie kann zum Testen murine Mikroglia Reaktion auf NPs und wie Mikrogliaaktivierung wirkt Hypothalamus Zellen als Ersatz Biosensor Marker verwendet werden. Die langfristige beabsichtigte Anwendung dieser validierten Modelleffekte aus der realen Welt Schadstoffen auf die Gesundheit des Gehirns und neurodegenerative Krankheit zu prüfen ist. Wir stellen eine detaillierte Beschreibung eines in vitro 96-Well – Format – Assay für die im Anschluss an die Belichtung von mic Mikroglia – Aktivierung und hypothalamischen Zellüberlebensmess roglial konditionierten Medien.

Mikrogliaaktivierung wurde nach AgNP Exposition bestimmt einen TNF-α Enzym Linked Immuno Assay (ELISA). Um die Wirkung von aktivierter Mikroglia auf Hypothalamus-Zellen zu bestimmen, wurden die AGNPS von Mikroglia-Überstand (konditioniertes Medium) unter Verwendung einer Filtrationsvorrichtung entfernt. Die Filtervorrichtung behält während Zytokine die AGNPS ohne basierend auf Größe. Kurz gesagt, Überstand aus mit oder ohne AGNPS behandelt Mikroglia wurde zu den Filtern gesammelt, zugegeben und bei 14000 × g für 15 min zentrifugiert. Wir waren dann in der Lage, den Einfluss von Mikroglia-Zytokine auf Hypothalamus die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Zelltoxizität zu konditionierten Medien (enthaltend Zytokine) nach der Belichtung wurde mittels eines Resazurin-basierten Assay bestimmt , wie zuvor beschrieben , ^5,6. Metabolisch aktive Zellen reduzieren Resazurin und ein Fluoreszenzsignal proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen ⁷ herzustellen.

nt "> Es gibt mehrere Vorteile dieses Verfahrens gegenüber anderen (zB Co-Kultur, trans-well – Setups oder in vivo – Experimente). Unser Modell die Fähigkeit Mikroglia direkt aktivieren liefert und festzustellen , ob sekretierten Faktoren Neuronen ⁸ toxisch sind . der aktuelle Protokoll verwendet immortalisierten BV2 Mikroglia mit 20 nm Durchmesser Nanopartikel stimuliert und immortalisierten murinen Hypothalamuszellen (mHypo-A1 / 2 bezeichnet) ⁹ zur Bestimmung der anschließenden Reaktion. Während dieses Protokoll für diese besonderen Bedingungen optimiert worden ist, können die Verfahren sein , verändert in anderen Modellen der Mikroglia-induzierten Zelltod verwendet werden, oder mit anderen Zelltypen, einschließlich primärer Mikroglia und Neuronen.