와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em> 소 결핵균</em> Bacille 칼 메트 - GUERIN
Summary
An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.
Abstract
수지상 세포 (DCS)는 배수 림프절 (DLN) 그들의 취득 능력 셔틀 항원을 부분적으로 면역 반응을 개시하는 것이 중요하다. DLN에 수지상 세포의 동원은 복잡하고 완전히 감염 동안 밝혀지지 남아있다. 여기 C57BL에 소 결핵균 Bacille 칼 메트 – GUERIN (BCG)과 발바닥 감염시 수지상 세포의 이동을 추적하기 위해 형광 색소 5와 6 카르복시 디 아세테이트의 숙신 이미 딜 에스테르 (CFSE)에 의존 혁신, 간단한 분석의 사용입니다 설명 / 6 마우스. 이 분석은 적극적으로 BCG에 대한 응답으로 배수, 오금 LN 이주 피부 DC 하위 집단의 특성을 수 있습니다. 이 프로토콜은 철새 피부 수지상 세포는 유동 세포 계측법에 의해 확인 하였다 BCG 모델에서 유래. 분석은 DC가 다른 세포의 연구 및 식별에 호감하다 집으로 오금 LN에 미생물 대사 산물 또는 염증 다른 접종 후이러한 세포의 이동을 조절하는 요인을 연구하기 위해 결과적으로 발바닥에 자극합니다.
Introduction
몸 표면에 국부적 인 수지상 세포는 미생물 또는 제품을 감지하고, 그렇게에 배수 LN (DLN) 1, 2에 림프관을 통해 동원. 이 재배치는 DLN 및 침입 미생물에 대한 면역 반응의 결과의 프라이밍에 미생물 항원의 수송을 위해 필요하다. DLN은 T 세포 반응 3-5 음소거에 실제로 수지상의 봉쇄 또는 실패는 감염된 조직에서 마이그레이션합니다. 따라서, 단일 세포 수준에서의 이동을 추적하기위한 분석은 주어진 DC 서브 세트 돌리다 이동성 기능을 도울 유용하다.
DLN에 피부 수지상 세포의 동원에 큰 데이터 본체가있다. 염증 또는 감염 사이트 2에서 DC 마이그레이션에 대한 지식의 대부분을 후자를 차지한다. 피부 수지상의 많은 인구를 수용하고 실험실 쥐에 실험을위한 매우있는 표면이기 때문에 이것은 놀라운 일이 아니다. 몇 가지 기술은 따라서 평가하기 위해 개발되어왔다DLN 2 피부에서 쥐의 수지상 세포의 이동. FITC 피부 페인팅까지 가장 많이 사용되는 방식으로있다. 이 분석에서, 형광 플루오 레세 인 -5- 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 아세톤 및 접촉 자극을 함께 혼합하여 제조된다. 이 칵테일 면도 한 면도 또는 피부에 도포하고 FITC 표지 된 세포의 축적이 DLN 분석 차례이다. 마이그레이션은 피부의 형광 입자를 내재화 한 대 식세포의 추적을 가능하게, 형광 표지 된 나노 – 또는 마이크로 입자와 피부에 주입하여 연구 될 수있다. 림프 혈관이 직접 림프에서 마이그레이션 수지상를 추출하기 위해 유관 될 수있다. 특히 생쥐 그러나 기술적 도전이다. 후속 분석을 위해 수득 된 수지상 세포의 수 또한 제한 요소이다.
피부 DC 마이그레이션에 많은 선행 연구에도 불구하고, DLN 다음 vacci에 피부 DC 동원에 관한 정보의 소수가 남아Bacille 칼 메트 – GUERIN (BCG), 소 결핵균의 라이브, 감쇠 변형과 국가는 M.에 대해 예방 접종에 사용 결핵. BCG는 T 헬퍼 세포 1 형 응답을 트리거 제한된 감염을 일으키는 원인이되는 피부에 접종한다. 둘 다이 과정에서 자신의 이동을 조절하는 BCG 감염 피부에서 DLN에 동원 직류 하위 집단과 요소는 완전히 이해되지 않습니다. 형광 색소 5- 및 6- 카르복시 디 아세테이트 숙시 니미 딜 에스테르 (CFSE)가 DLN (3)에 DC에서의 이동을 추적하는 반응계에 주입되는 경우, 상기에 비추어, 간단하면서도 신규 한 방법이 개발되었다. C57BL / 6 마우스는 BCG의 접종 희생 전날과 뒷다리 발바닥에 주입되고, 동물 CFSE의 고농도와 같은 발바닥에 주입된다. 24 시간 후에 동물을 희생하고 배수 오금 LN (PLN)을 제거하고 유동 세포 계측법에 대 한 준비가되어 있습니다. 이 분석은 IDE를 할 수 있습니다DLN에 발바닥 피부에서 하룻밤 마이그레이션 세포 (그림 1)의 ntification.
또한, 유전자 타겟팅은 생쥐에 DLN 동원 세포에 필요한 요소를 식별하는데 사용될 수있다. 이 분석을 사용하여,이 보고서의 저자가 이전에 발견하는 인터루킨 -1 수용체 및 세포 내 어댑터 분자에서 MyD88 (3)에 의해 규제 프로세스의 DLN로는 EpCAM 낮은 CD11b를 높은 철새 피부 수지상 전송 BCG는. 유동 세포 계측법은 이동성 피부 수지상을 검출하고 분석하는 데 사용 된 Bollampalli 외. (3)에 의해 상기 리포트에서 유래이 CFSE 기반 이동 분석을위한 프로토콜이 설명된다. 장점이 분석의 단점이 논의된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
noDCs 미생물 항원을 획득하고 림프관을 통해 DLN로 마이그레이션하여 신체 표면에서 미생물의 도전에 대응할 수있는 전문 항원 제시 세포이다. 거기에서, 수지상 차 T 세포 반응을 구동하는 방식으로 T 세포에 항원을 제시이. DLN으로 조직으로부터 DC 이전의 과정은 생산 T 세포 반응을 개시하는 방법을 이해하기위한, 따라서 매우 중요하다. DC 마이그레이션을 측정하는 방법은 결과적으로 위의 전개에 매우 유용하다.
마우스 모델은 BCG 피부에서 임상 주입 생백신 감염 DLN 다음에 피부 DC 마이그레이션을 연구하는데 사용 하였다. 행에서, BCG 예방 접종이 피부 경로를 모방하기 위해 뒷다리 발바닥에 주입된다. 간단한 분석은 개발 결과적으로 배수 PLN에 발바닥 피부의 BCG 접종 부위에서 피부 DC 하위 인구의 이동을 조사하기 위해이 모델에 통합되었다. 이 프로토콜 RELI이전 BCG를 수신 동일한 발바닥에 형광 색소 CFSE 주입 후 유세포 CFSE 표지 된 세포의 존재를 분석 후에 배수 PLN 24 시간 분리에 에스. 프로토콜에 설명되어 있지 않지만,이 설정에서 림프절는 또한 이동성 LN 3 셀의 위치로 이동 과정을 연구하기 위해 공 초점 현미경 분석을 위해 제조 될 수있다. 또한, BCG 트리거 피부 DC 마이그레이션에 유사한 결과는 BCG 모두 파스퇴르 1173P2 3 BCG SSI 1331 (14)를 사용하여 얻어졌다.
CFSE 일반적으로 시험관 내에서 세포를 라벨 세포 전달 15 일 이후 생체 내에서 세포와 같은 표지를 추적하는 데 사용된다. 비록 현재의 프로토콜에서, 바로 현장에서 피부 세포에 라벨을 사용 하였다. CFSE 표지 분자 기초는 아민 반응성 인 FITC 형광 염료, 유사하다. 이 CRE로 CFSE 그러나 접합 대한 FITC보다 선호ATES 매우 안정 카르 채권 16. 또한, CFSE 매우 막 투과성이고 수동적 세포로 확산. 일단 내부, 그것은 세포 내 아민 (형광) 표지 셀 (15)에 유지됩니다 접합체를 형성한다.
저자에 의해 개발 된 CFSE 기반 마이그레이션 분석은 BCG에 응답하여 24 시간 이내에 피부에서 DLN 재배치 세포의 식별을 가능하게한다. 이는 따라서 정해진 기간 동안 급성 이동을 측정하고 다른 하나의 능력을 조사 할 수 있도록, 이동을 유발하는 자극을 주입. 이 분석은 접촉 증감 제의 피부, 국소 적용에 의해 트리거 누적 마이그레이션 이벤트를 측정 FITC 피부 회화의 전통적인 기술과는 다릅니다. 따라서, CFSE 기반 마이그레이션 분석은 이동성 피부 수지상 또는 F에서 미생물, 미생물 제품 또는 다른 염증성 자극의 주입 후 PLN 곳 다른 셀을 식별하기 위해 사용될 수있다ootpad. 실제로, 호중구 및 γ 둘 : δ T 세포는 BCG (17, 18)에 응답 DLN 피부에서 원치 것으로 나타났다. 사실, 분석은 최근 장 지역화 선충의 감염이 DLN (14)에 BCG 트리거 피부 DC 마이그레이션을 음소거 수 있다는 것을 보여주기 위해 공동 감염 설정에 사용되었다.
DC 마이그레이션은 종종 DC가 19 페인팅 후 4 ~ 5 일을 감지하기 어려운 FITC 표지부터 24 FITC 피부 회화 시간 72 사이에 평가된다. 이주의 분석은 24 시간으로 제한 된 이후 레이블의 DC에 CFSE 신호의 손실은 여기에 제시된 분석에서 문제가되지 않습니다; 이 저자가 특별히 공부 "하룻밤"마이그레이션 이벤트를 원했다는 것을 뒤에 이유. 이 분석에 관심있는 사람들은 그러나 CFSE 기반 추적에 대한 이전 또는 이후의 시점을 조사하는 것이 좋습니다. CFSE 사출에 의해 도입되기 때문에, 또, 어떤 정의 된 시간에 주어질 수있다. 이러한 유연성은 A 허용uthors는 BCG 감염 (그림 2C) 3 후 하루 5와 6 사이의 DC 마이그레이션을 평가합니다. 주입 잠재적 CFSE 표지 반응 시츄 접근 세포 유형을 제한 할 수있다. 피부의 최상층에있는 DC에있는 인스턴스 랑게르한스 세포 (LCS)에 대해서는, 표피 (도 3) 3 CFSE 기반 이동 분석에서 BCG에 응답 제대로 이동한다. 그러나, FITC 피부 페인팅, 진피에 위치 수지상 동안, 표피 아래 층은 쉽게 표시되어 빠른 LC를 20, 21보다 DLN로 이동한다. 이것은 세포를 형광 표지 될 수 있다는 것을 반드시 라벨 솔루션이 적용되는 피부의 층에 지역화없이 제시한다.
BCG 감염의 모델로, 마우스 귀는 더 결핵 백신으로 BCG의 임상 적 관리와 라인에 접종의 선의의 피내 경로를 제공합니다. FO한편 otpad 분사 가능성 피내 및 피하 경로의 조합이다. 즉, 임상에서 항상 진정으로 피내 주어 오히려 피하 또는이 둘의 조합되지 않을 수도 있습니다 정확하고 재현성, 진피 (22)에 BCG를 제공하는 기술과 훈련이 필요했다. 접종 사이트로 발바닥은 언급 장점 귀를 통해이 매우 분명 장점을 가지고있다. 우선, 면역 반응은 발바닥 주사 다음 배수 PLN 농축 이는 반응의 검사를 용이하게한다. 이 보고서의 저자는 PLN은 발바닥 3 배수 제 주 LN 것으로 나타났습니다. 다른 사람들은 에반의 파란색 (23)의 주입 후 오금 및 subiliac 림프절 사이의 분할 배수를 제안했다. 그럼에도 불구하고, 귀에 관해서,이 마우스에서 하나 이상의 귀 DLN이며, 이들은 정기적으로 현재 또는 (24)를 쉽게 찾을 수 없습니다. 후자는 분명히 liab을 소개합니다DLN의 반응을 조사하고자하는 연구 ility. 귀 비교 – (50 μL 10) 둘째, 더 큰 볼륨은 발바닥에 접종 할 수있다. 이것은 차례로 모두 림프 유동에 큰 변화를 도입하고 마이코 박테리아의 대량 접종에 관해서 자체에 문제가 매우 작은 주입량 함께 작동해야하는 책임의 최소화. 사출 볼륨이 작은 (1 ~ 10 μL)해야 귀에도 5 μL는 림프의 흐름을 바꿀 수 있으며, 잠재적으로 통제되지 않은 방식으로 직접 DLN에 주입 된 물질의 많은 양을 강제로. 주입 볼륨을 고려하는 것이 중요하다. 이것은 LN에 박테리아 배로 건네 세포의 기여를 어드레싱 실험에서 특히 중요하다. BCG 풋 모델 일부 BCG 셀룰러 전송의 부재에 DLN 도달 할 수있다. 이것은 하나 여전히 발에서 마우스의 DLN 곳에서 세포 이동을 BCG를 검출 할 수있는 관찰에 기초패드는 완전히 백일해 독소 (3) 지방 주입에 의해 절제 하였다. 이러한 BCG 직접 림프관 액세스 진정한 무 세포 방식 DLN 도달 할 수 있다는 표시를 할 것인가 아닌가를 배제 할 수 없기 때문에 판단 될 남아 주입 부피 강제 림프관 액세스를 부여이 경우 마이코 박테리아.
귀 또는 발바닥의 접종하기위한 실용적인 고려 주사 정확하고 재현 가능한 방식으로 수행 될 때까지 동물을 적절하게 고정 될 필요가 있다는 것이다. 이소 플루 란 가스 발바닥 주사 준비 동물을 억제하기위한 방법으로서, 현재의 프로토콜을 설명한다. 이소 플루 란 매개 마취의 비교적 빠른 유도 및 복구 시간은 인기있는 방법 만들지 만, 다른 마취제와 마찬가지로,이 실험 결과 25를 방해 할 수 있습니다 생리에 영향을줍니다. 실제로, 휘발성 마취제 주사 모두 폐지하여 림프 흐름을 감소수의근 운동 근육을 감소시키고 lymphangion 수축 (26)을 감소시킨다. 또한, 적응 적 발바닥에 전달 수지상의 DLN 마이그레이션의 5 배 감소는 마취 된 동물 (27)에보고되었다. 상기를 감안 전에 마취로 처리 절차 때문에 관리가 모두 신속하고 회수하는 단계를 요구하지 않는 주사 자체보다 동물에 더 스트레스를 야기 할 가능성이있는 가능성이 충분히 마취없이 동물을 억제하기해야 간주 될 수있다. 동물 빠르게 30-40 초 이내에 발바닥에 고정 위치에 위치 접종 할 수 발바닥 주사를위한 맞춤형 마우스 제한 수단은 실행 과정에서 생리학의 다른 측면을 변경하지 않고 뒷다리 발바닥에 마우스를 주입하는 것이 이상적 및 림프관을 통해 세포 이동을 다루는 연구에 매우 유용 할 것이다.
결론적으로,이 보고서정의 된 24 시간의 기간 동안 마이그레이션을 모니터링하는 분석을 사용하여 DLN 그들의 동원 동안 피부 수지상 세포를 추적하기위한 새로운 프로토콜을 강조한다. 이 CFSE 기반 마이그레이션 분석은 여기에 설명 된대로, 유동 세포 계측법뿐만 아니라, 공 초점 현미경 (3)에 의한에 의해 탐지 및 철새 세포의 분석을 할 수 있습니다. 그것은 주입 자극의 다양성과 DC의 이동을 유발하는 능력을 연구 유연한 플랫폼을 제공하고, 중요하게, DC가 아니라 다른 실험 설정 중에 DLN 피부에서 이동하는 다른 집단뿐만 추적하는데 이용 될 수있다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Karolinska Institutet, a project grant from the Swedish Research Council VR (Dnr 2014-2794) and a KID Doctoral Grant from Karolinska Institutet (All to A.G.R). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| EDTA | In house | ||
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | In house | ||
| Filtered water | In house | ||
| BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
| 5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
| Univentor 400 anaesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Monojet 3/10ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
| Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
| EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
| Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
| Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
| 0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
| 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
| 70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
| BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
| FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
| Antibody | Clone | Company | |
| Antibodies | |||
| MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
| CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
| CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
| CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
| CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
| CD103 | 2E7 | Biolegend | |
| CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
| CD86 | GL-1 | Biolegend |
Referenzen
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