基于CFSE-试验鼠皮肤树突状细胞的迁移习进引流淋巴结在与感染<em>牛分枝杆菌</em>卡介苗

国家海洋资料中心是专门的抗原呈递细胞，可以以微生物挑战在身体表面通过获取微生物抗原和经淋巴管迁移到DLN响应。那里，树突呈现这种抗原至T细胞的驱动初级T细胞应答的方式。直流偏移的从组织到DLN过程因此非常重要的是理解一个生产性T细胞应答是如何启动的。方法测量直流偏移是在随后展开上述非常有用的。

小鼠模型被用于研究感染后卡介苗，即在皮肤注射临床活疫苗皮肤DC迁移DLN。线，卡介苗在后脚垫注射模仿接种此皮肤路由。一个简单的试验，开发，因此并入该模型来研究皮肤直流子种群从足垫皮肤排水PLN卡介苗接种部位的迁移。该协议RELI上注入荧光CFSE成先前接收的BCG相同足垫，然后后来分离该排水PLN 24小时通过流式细胞仪来分析CFSE标记的细胞的存在的ES。虽然在协议没有描述，这种设置逻辑节点也可用于通过共聚焦显微镜分析制备，研究迁移过程，如迁移细胞在LN ³的定位。此外，同时使用BCG巴斯德1173P2 ³和BCG SSI 1331 ¹⁴已经获得了卡介苗引发的皮肤DC的迁移类似的结果。

CFSE通常用于标记细胞在体外和细胞转移后¹⁵跟踪体内这种标记的细胞。在当前的协议虽然，它被用于直接标记的皮肤细胞在原位 。 CFSE标记的分子基础是类似于FITC，这也是一种胺 – 反应性荧光染料。然而CFSE优于FITC缀合，因为它CRE阿泰非常稳定甲酰胺债券^16。此外，CFSE是高度膜渗透性和被动扩散进入细胞。一旦进入，它形成内胺（荧光），该保留在标记的小区¹⁵的缀合物。

由作者开发的基于CFSE移民法使细胞响应BCG 24小时的期限内搬迁的皮肤DLN的鉴定。一个定义的时间段内因此，它衡量急性迁移和允许一个研究不同的能力，注入刺激引发的迁移。该测定距离的FITC皮肤绘画的经典技术，其测量由一个接触增敏剂的皮下，局部应用引发了累积迁移事件不同。因此，基于CFSE迁移法可用于鉴定洄游皮肤树突或其它细胞家到PLN微生物，微生物产品或其他炎性刺激的的F注射后ootpad。的确，嗜中性粒细胞和γ;δT细胞已显示出从皮肤响应移居到DLN卡介苗^17,18。事实上，在测定最近使用在共感染设置以表明一个肠道局部线虫感染可以忽略卡介苗触发皮肤DC迁移到DLN ^14。

直流偏移通常之间24到72小时，在FITC皮肤画自FITC-标记的评估DC是困难画¹⁹后4至5天检测。标有区议会CFSE信号的损失是不是在这里给出的分析问题，因为移民的分析仅限于24小时;这是，作者要专门研究“一夜之间”迁移事件背后的原因。然而，有兴趣在该试验中其他各方应探讨了基于CFSE跟踪早期甚至更晚的时间点。此外，由于CFSE通过注射引入它可以在任何规定的时间给出。这种灵活性允许一个uthors评估BCG感染（ 图^2C）3后第5天和第6天之间的DC偏移。注入CFSE可能限制原位标记反应访问的细胞类型。例如朗格汉斯细胞（LCS）这是驻留在皮肤的最上层的DC，表皮，不良迁移响应于卡介苗在基于CFSE迁移测定（ 图^3）3。然而，FITC皮肤画，位于真皮的DC期间，表皮下的层，可以容易地标记，并迁移到DLN比的LC ^20,21更快。这表明，细胞可成为荧光物质标记的，而不一定需要本地化到被施加标记溶液的皮肤层。

至于BCG感染模型中，小鼠耳接种提供了真正的皮内路由更符合BCG的临床管理作为结核疫苗线。佛另一方面otpad注射，很可能在皮内和皮下途径的组合。这就是说，它需要技巧和训练来正确地和可重复性地递送卡介苗到真皮^22，因此在临床实践中它可能不总是真正皮内给予，而是皮下或两者的组合。作为接种部位的脚掌确实有过这值得一提的耳朵两个非常明显的优势。首先，免疫应答浓缩至以下一个足垫注射排水PLN和这便于响应的检查。该报告的作者发现PLN成为第一个与主排水LN足垫^3。其他人伊文思蓝²³注射后提出的腘窝和subiliac LNS之间分流排水。尽管如此，在问候耳，有一个以上的耳DLN小鼠和这些可能不经常存在或易于定位^24。后者明确地引入了牌照上诉委员会ility在寻求调查DLN反应的研究。第二，较大的体积可以被接种到足垫 – 比耳（10 50微升）。这又减少了双方在淋巴回流引进重大变化，并具有非常小的注射量，这本身就是一个问题，当谈到接种大量分枝杆菌的工作的责任。在注射体积必须小（1-10微升）耳，甚至5微升可能改变淋巴回流的和潜在迫使注入的材料的更大的量直接进入DLN以不受控制的方式。它占注射体积是重要的。这是在实验中处理的细胞中运送细菌至LN的贡献尤其重要。在BCG足垫模型中，一些BCG可能已经达到在无细胞运输的DLN。这是基于一个可以仍然从足检测BCG的小鼠的DLN，其中细胞迁移的观察垫完全由局部注射百日咳毒素³的消融。这是否是指示卡介苗可以直接访问淋巴和在一个真正的无细胞的方式到达DLN仍有待确定，因为它不能排除的是在这种情况下，其中通过注入体积的力给定接入到淋巴管分枝杆菌。

在耳或足垫免疫一个实际考虑是，动物已经得到充分固定注射到正确和可重复的方式进行的。异氟烷气体在当前协议以抑制动物中为足垫注射制备方法中描述。对异氟烷-介导麻醉的相对快速诱导和恢复时间使其成为流行的方法，但类似于其他麻醉剂，它会影响生理，其可以与实验结果²⁵干涉。事实上，易失性和注射麻醉药废除减少淋巴流动随意肌的运动，减轻肌张力，降低lymphangion收缩^26。此外，在迁移5倍减少到DC的DLN在足垫继转移已经报道在麻醉动物^27。鉴于上述情况，并且由于麻醉前的处理程序都可能引起更多的压力给动物比注射本身，这是既快速施用，并且不需要回收步骤的可能性，以充分抑制动物没有麻醉剂应加以考虑。定制足垫注射剂，其中动物能在30至40秒内迅速带到一个固定的位置，并接种在足垫鼠标阻挡器将是理想的注入在后脚垫鼠标而不改变其生理学的其他方面的过程中，并会在研究中通过淋巴管解决细胞迁移是非常有用的。

总之，本报告突出了使用该定义的24小时的窗口时监控迁移的测定他们动员到DLN期间跟踪皮肤的DC了一种新的协议。这种基于CFSE迁移测定法允许通过流式细胞术，如这里详细描述的，以及通过共聚焦显微镜³检测和游走细胞的分析。它提供了一个灵活的平台用于研究各种注射刺激和其触发的DC迁移能力，并且重要的是，可以采用跟踪不仅树突而且其他人群中不同的实验设置从皮肤转移到DLN。