Flödescytometri-baserad analys för övervakning av NK cellfunktioner
Summary
En enkel och tillförlitlig metod beskrivs här för att analysera en uppsättning funktioner NK cell såsom degranulering, cytokin och kemokin produktion inom olika NK cellundergrupper.
Abstract
Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.
Introduction
Som en del av det medfödda immunförsvaret naturliga mördarceller (NK-celler) bidrar till den första försvarslinjen mot virusinfekterade eller malignt transformerade celler. Ett system av hämmande och aktiverande receptorer gör det möjligt att skilja mellan friska och transformerade celler utan föregående antigen priming i motsats till T-celler. Vid målcellen möter NK-celler frigör innehållet i sina cytotoxiska granuler (t.ex. perforin, granzymes) in i den immun synapsen för att döda deras mål. Dessutom NK-celler producerar och utsöndrar olika cytokiner (t.ex. interferon-y: IFN-γ; tumörnekrosfaktor-α: TNF-α) och kemokiner (t.ex., makrofaginflammatoriskt protein-1β: MIP-1 p) vid målcell interaktion eller cytokinstimulering 1.
Tillräckliga funktioner NK cell såsom cytotoxicitet, kemokin och cytokinproduktion har en stor inverkan på öde olika dislättar. Leukemipatienter visar ökad återfall om de uppvisar en defekt NK-celler profil vid diagnos består av minskad produktion IFN-γ och minskat uttryck att aktivera NK cellreceptorer 2. En tidig återhämtning av NK cell nummer och funktion inklusive cytokinproduktion vid interaktion målcell är förknippad med en minskad återfall och förbättrad överlevnad hos patienter som får allogen stamcellstransplantation 3. Dessutom vid initiering av interferonbehandling hos patienter hepatit C-virusinfekterade degranulering kapacitet perifera NK-celler är starkare i tidiga responders än hos icke-responders 4. Nummer NK-celler (> 80 / l) på dag 15 efter autolog stamcellstransplantation (autoSCT) hos patienter som lider av lymfom eller multipelt myelom är prediktiva för en förbättrad progressionsfri och total överlevnad fem. I melanompatienter uttrycket av T-cell immunoglobulin- och mucin-domän-containing molekyl-3 (TIM-3), ett immunreglerande protein på NK-celler, korrelerar med sjukdomsstadium och prognos 6.
Forskare har följt NK cellfunktioner under de senaste decennierna. Den inledande analysen av NK cytotoxicitet mot tumörceller utan föregående priming riktades med hjälp av en 51 Cr-frisättningsanalys 7. Mer nyligen, forskare utvecklat en icke-radioaktiv metod för att utvärdera cytotoxiciteten av expanderade NK-celler 8. Cytokin och kemokin produktion har ofta utvärderas med hjälp av enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) tekniker 9,10. Under de senaste decennierna dessa metoder har kompletterats med flödescytometri-baserade analyser. Användningen av proteinhämmare transport (t.ex. Brefeldin A och monensin) och cell permeabilization metoder i kombination med konventionell ytfärgning protokoll har gjort det möjligt för forskare att studera kemokin och cytokinproduktion i olika specifika lymfaocyte grupper (t.ex. T, B eller NK-celler) 11. Dessutom har olika flödes cytometry baserade analyser utvecklats för att övervaka T och NK-cell cytotoxicitet. År 2004 beskrev Alter et al. Ytan uttryck av lysosomen-associerat protein CD107a (Lampa 1) på NK-celler på målcell möter som en markör för degranulering av cytotoxiska granuler 12. Eftersom ett stort antal olika fluorokromer och flerkanaliga flödescytometrar finns i våra dagar har det blivit möjligt att samtidigt övervaka olika NK cellfunktioner (cytotoxicitet, cytokin och kemokin produktion) i olika NK cellgrupper. Detta blir särskilt viktigt i situationer där provstorleken är begränsad, till exempel, i biopsier eller blodprover från patienter som lider av leukopeni.
För att testa globala NK cellfunktioner kan olika flödescytometri baserade analyser effektivt kombineras. Theorell et al. Stimulerade NK-celler från healthy donatorer med tumörcellinjen K562 och analyserades NK-cell degranulering, inifrån och ut-signal och kemokinproduktion via flödescytometri 13. Nyligen NK cellgrupper, fenotyper och funktioner i tumörpatienter under autoSCT analyserades med flödescytometri-baserade analyser. Det visades att NK-celler kunde degranulate och producera cytokiner / kemokiner vid tumörcelligenkänning i mycket tidiga tidpunkter efter autoSCT 11.
Här ett protokoll beskrivs att utvärdera NK cellfunktioner vid interaktion med tumörceller inkluderande degranulering kapacitet, kemokin och cytokinproduktion med användning av en flödescytometri-baserad analys som gör det möjligt att övervaka NK cellfunktioner i olika undergrupper samtidigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det beskrivna förfarandet är ett enkelt, snabbt och pålitligt tillvägagångssätt för att studera NK cellfunktioner från helblod från friska givare eller patienter. Denna metod erbjuder den stora fördelen att direkt rena NK-celler från helblod, som man undviker den tidsödande densitetsgradientcentrifugering, som är obligatoriskt för många andra reningsmetoder 15. Dessutom kräver det ett mindre urval storlek jämfört med "klassiska" NK-celler isolering / anrikningsmetoder, vilket gör …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.
Materials
| RPMI 1640 + glutamine | Invitrogen | 6187-044 | |
| penicilin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Falcon Round Bottom Tube | BD | 352008 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270-106 | heat inactivated before use |
| T-flask | Greiner Bio-One | 690195 | |
| K562 tumor cell line | DSMZ GmbH | ACC 10 | |
| ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer | made in house | / | components are listed in the text |
| Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur | Fresenius Kabi | 1088813 | |
| Megafuge 40R Centrifuge | Heraeus | / | |
| EDTA blood collector tubes | Sarstedt | 386453 | S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Hematopoietic media (XVIVO) | Lonza Group Ltd | BE04-743Q | |
| human serum | DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M | / | healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use |
| Neubauer-improved counting chamber, bright line | Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. | 0640030/ 1110000 | |
| trypan blue solution (0,4%) | Invitrogen | 15250-061 | |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 07060 | |
| Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates | Corning | 3894 | |
| Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates | Corning | 351177 | |
| DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) | Gibco Invitrogen | 14190-169 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153-100G | |
| NaN3 | Sigma Aldrich | 08591-1ML-F | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Merck | 524400-1MG | |
| ionomycin | PromoKine | PK-CA577-1566-5 | |
| interleukin 15 (IL-15) | PeproTech | 200-15 | |
| Proleukin S (IL-2) | Novartis Pharma | 730523 | |
| Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested. |
| Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| paraformaldehyde | AppliChem | UN2209 | |
| saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| flow cytometer: Canto10C | BD Biosciences | / | |
| FlowJo | TreeStar Inc. | / | |
| Graph Pad | Graph Pad Inc. | / | |
| MACSxpress Separator | Miltenyi Biotec | 130-098-308 | |
| MACSxpress NK isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-098-185 | |
| MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-098-196 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| anti-human CD3 APC | Biolegend | 300412 | |
| anti-human CD3 V450 | BD Biosciences | 560366 | |
| anti-human CD14 PerCP | Miltenyi Biotec | 130-094-969 | |
| anti-human CD14 V450 | BD Biosciences | 560349 | |
| anti-human CD16 PE | Biolegend | 302008 | |
| anti-human CD16 PerCP | Biolegend | 302029 | |
| anti-human CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 302216 | |
| anti-human CD19 V450 | BD Biosciences | 560353 | |
| anti-human CD45 BV510 | BD Biosciences | 563204 | |
| anti-human CD56 FITC | Biolegend | 345811 | |
| anti-human CD107a PE | Biolegend | 328608 | |
| anti-human IFN-γ AF-647 | BD Biosciences | 557729 | |
| anti-human MIP-1β APC-H7 | BD Biosciences | 561280 | |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Kit | Biolegend | 423113 | fixable dead cell marker |
Referenzen
- Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
- Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
- Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
- Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
- Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
- Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
- Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. “Natural” killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
- Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
- Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
- Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
- Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
- Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
- Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
- Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
- Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
- Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
- Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
- Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
- Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
- Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
- Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin’s lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
- Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
- Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
- Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
- Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
- Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
- Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
- Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).
