흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법
Summary
간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.
Abstract
Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.
Introduction
선천성 면역 시스템 자연 살해의 일환으로 (NK) 세포는 바이러스에 감염된 또는이 악 형질 전환 된 세포에 대한 방어의 첫 번째 줄에 기여한다. 억제 및 활성화 수용체 시스템은 T 세포와 대조적으로 종래 항원 프라이밍없이 건강하고 형질 전환 된 세포를 구별하도록 할 수있다. 대상 셀의 만남에 NK 세포는 자신의 목표를 죽이는 면역 시냅스에 자신의 세포 독성 과립 (예를 들면, 퍼포, granzymes)의 내용을 놓습니다. 타겟 셀시 (MIP-1β 예, 대 식세포 염증 단백질 1β) 및 케모카인 :; 또한, NK 세포는 다른 사이토 카인의 종류 (TNF-α, 종양 괴사 인자 α IFN-γ 예, 인터페론 γ)를 생성 및 분비 상호 작용 또는 사이토 카인 자극 한.
이러한 세포 독성, 케모카인 및 사이토 카인 생성 충분한 NK 세포의 기능은 다양한 DIS의 운명에 중요한 영향을 미칠용이하게합니다. 그들은 감소 IFN-γ 생산과 NK 세포 수용체 2를 활성화 감소 식으로 구성된 진단에서 결함이 NK 세포 프로파일을 나타내는 경우 백혈병 환자는 재발 속도를 증가 보여줍니다. 표적 세포의 상호 작용에 따라 사이토 카인 생성을 포함하여 NK 세포의 수 및 기능의 조기 회복 조혈 모세포 이식 3을받은 환자에서 재발 감소 향상된 생존율과 연관된다. 또한, C 형 간염 바이러스에 감염된 환자에게 인터페론 요법의 개시시 주변 NK 세포의 탈과립 용량 비 반응자 (4)보다 조기에 대응 강하다. NK 세포 수는 (> 80 / μL) 임파종 또는 다발성 골수종을 앓고있는 환자에서는자가 줄기 세포 이식 (autoSCT) 후 15 일이 향상된 무 진행하고 생존율 5 예측된다. 흑색 종 환자에서 T 세포의 발현 및 immunoglobulin- 뮤신 – 도메인 containing 분자-3 (TIM-3), NK 세포에 대한 면역 조절 단백질은 병기와 예후 (6)와 상관 관계.
과학자들은 지난 수십 년에 걸쳐 NK 세포의 기능을 관찰 하였다. 앞서 프라이밍없이 종양 세포에 NK 세포 세포 독성의 초기 분석은 51 크롬 방출 분석을 사용하여 7 해결 하였다. 최근에 과학자들은 확장 된 NK 세포 (8)의 세포 독성을 평가하기위한 비 방사능 방법을 개발 하였다. 사이토 카인 및 케모카인 생산은 흔히 효소 면역 분석법 (ELISA) 방법을 사용하여 평가 9,10되었다. 지난 수십 년 동안 이러한 방법은 유동 세포 계측법 기반 분석에 의해 보완되고있다. 종래의면 염색 프로토콜과 함께 수송 단백질 억제제 (예 brefeldin A 및 넨신) 세포 permeabilization 방법의 사용은 다른 특정 림프에서 케모카인 및 사이토 카인 생성을 연구 과학자 활성화ocyte 서브 세트 (예를 들어, T, B 또는 NK 세포) 11. 또한, 다른 유동 세포 계측법 기반 분석법은 T 및 NK 세포의 세포 독성을 모니터링하도록 개발되었다. 2004 년 알터는 외. 독성 입자 (12)의 탈과립을위한 마커로서 표적 세포의 발생에 NK 세포의 리소좀 – 관련 단백질 CD107a (램프 1)의 표면 발현을 설명했다. 상이한 형광 색소 및 멀티 채널 유동 세포 계측기 다양한 우리 일에서 유효하기 때문에, 동시에 다른 NK 세포 서브 세트의 다양한 NK 세포의 기능 (세포 독성, 사이토 카인 및 케모카인 생산)를 모니터링 할 수있게되었다. 이 생검 또는 백혈구 감소증을 앓고있는 환자의 혈액 샘플에서 예를 들면 샘플 크기를 제한하는 상황에서 특히 중요해진다.
글로벌 NK 세포의 기능을 테스트하기 위해, 상이한 유동 세포 계측법 기반 분석을 효율적으로 결합 될 수있다. 테오 등. 난방에서 자극 NK 세포lthy의 종양 세포주 K562와 도너 13 유세포 통해 NK 세포 탈과립, 인사이드 – 아웃 신호 및 케모카인 생산을 분석 하였다. 최근 NK 세포의 하위 집단은 표현형 autoSCT 동안 종양 환자 기능 계측법 기반 분석법 흐름으로 분석 하였다. 또한 NK 세포 및 degranulate autoSCT 11 후 초기 시점에서 종양 세포를 인식시 사이토킨 / 케모카인을 생성 할 수 있다고 입증되었다.
여기 프로토콜 탈과립 용량, 케모카인 및 사이토 카인 생성을 포함하여 종양 세포가 가능한 동시에 상이한 서브 세트에서 NK 세포의 기능을 모니터 할 수 유동 세포 계측법 기반 분석법을 이용하여 상호 작용시 NK 세포의 기능을 평가하기 위해 설명된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명 된 방법은 건강한 기증자 또는 환자의 전혈 시료로부터 NK 세포의 기능을 연구하기 쉽고, 빠르고 신뢰성있는 방법이다. 이 방법은 피 직접 전혈로부터 NK 세포를 정제 할 수있는 큰 이점을 제공하는 시간 소모적 인 많은 다른 정제 방법 15 필수 밀도 구배 원심 분리. 또한, 그것은 소아 및 / 또는 면역 결핍 환자의 샘플에 대한 적절한 대체한다 "클래식"NK 세포 분리 / 농축 방법에 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.
Materials
| RPMI 1640 + glutamine | Invitrogen | 6187-044 | |
| penicilin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Falcon Round Bottom Tube | BD | 352008 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270-106 | heat inactivated before use |
| T-flask | Greiner Bio-One | 690195 | |
| K562 tumor cell line | DSMZ GmbH | ACC 10 | |
| ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer | made in house | / | components are listed in the text |
| Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur | Fresenius Kabi | 1088813 | |
| Megafuge 40R Centrifuge | Heraeus | / | |
| EDTA blood collector tubes | Sarstedt | 386453 | S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Hematopoietic media (XVIVO) | Lonza Group Ltd | BE04-743Q | |
| human serum | DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M | / | healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use |
| Neubauer-improved counting chamber, bright line | Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. | 0640030/ 1110000 | |
| trypan blue solution (0,4%) | Invitrogen | 15250-061 | |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 07060 | |
| Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates | Corning | 3894 | |
| Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates | Corning | 351177 | |
| DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) | Gibco Invitrogen | 14190-169 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153-100G | |
| NaN3 | Sigma Aldrich | 08591-1ML-F | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Merck | 524400-1MG | |
| ionomycin | PromoKine | PK-CA577-1566-5 | |
| interleukin 15 (IL-15) | PeproTech | 200-15 | |
| Proleukin S (IL-2) | Novartis Pharma | 730523 | |
| Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested. |
| Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| paraformaldehyde | AppliChem | UN2209 | |
| saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| flow cytometer: Canto10C | BD Biosciences | / | |
| FlowJo | TreeStar Inc. | / | |
| Graph Pad | Graph Pad Inc. | / | |
| MACSxpress Separator | Miltenyi Biotec | 130-098-308 | |
| MACSxpress NK isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-098-185 | |
| MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-098-196 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| anti-human CD3 APC | Biolegend | 300412 | |
| anti-human CD3 V450 | BD Biosciences | 560366 | |
| anti-human CD14 PerCP | Miltenyi Biotec | 130-094-969 | |
| anti-human CD14 V450 | BD Biosciences | 560349 | |
| anti-human CD16 PE | Biolegend | 302008 | |
| anti-human CD16 PerCP | Biolegend | 302029 | |
| anti-human CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 302216 | |
| anti-human CD19 V450 | BD Biosciences | 560353 | |
| anti-human CD45 BV510 | BD Biosciences | 563204 | |
| anti-human CD56 FITC | Biolegend | 345811 | |
| anti-human CD107a PE | Biolegend | 328608 | |
| anti-human IFN-γ AF-647 | BD Biosciences | 557729 | |
| anti-human MIP-1β APC-H7 | BD Biosciences | 561280 | |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Kit | Biolegend | 423113 | fixable dead cell marker |
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