Un<em> In Vitro</em> Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

La barrera sangre-cerebro separa la circulación sistémica desde el sistema nervioso central (CNS) ^1-3. Proporciona una barrera física que impide la libre circulación de las células y la difusión de las moléculas solubles en agua y protege al cerebro de los agentes patógenos y sustancias potencialmente dañinas. Además de su función de barrera, la acreditación permite la entrega de oxígeno y nutrientes a la parénquima cerebral, lo que garantiza el correcto funcionamiento del tejido neuronal. Propiedades funcionales de la BHE son altamente reguladas por sus componentes celulares y acelulares, con muy especializado EC siendo su principal elemento estructural. ECs de la BBB se caracterizan por la presencia de uniones estrechas (TJ) complejos, la falta de fenestraciones, extremadamente baja actividad de pinocitosis, y los mecanismos de transporte permanentemente activos. Otros componentes de la acreditación de la membrana basal CE, pericitos incrustar el endotelio, pies terminales astrocíticos y = par asociadoenchymal membrana basal también contribuir al desarrollo, el mantenimiento y la función de la BBB ^{2,4 – 6} y, junto con las neuronas y la microglia, forman la unidad neurovascular (NVU), que permite buen funcionamiento del CNS ^7-9.

En una variedad de enfermedades neurológicas, tales como enfermedades neurodegenerativas, inflamatorias o infecciosas, la función de la BBB se ve comprometida ^2,5,10. La desregulación de TJ complejos y mecanismos de transporte molecular conduce a una mayor permeabilidad de la BHE, la extravasación de leucocitos, la inflamación y el daño neuronal. Con el fin de estudiar BBB propiedades bajo tales condiciones fisiopatológicas, varios modelos de BBB in vitro han establecido ^9,11,12. Juntos han proporcionado información valiosa sobre los cambios de la integridad de la barrera, permeabilidad, así como mecanismos de transporte. Estos modelos emplean células endoteliales de los humanos, de ratón, rata, porcino o b^{13 de} origen ovino ^{– 18;} células endoteliales primarias o líneas de células son cultivadas, ya sea como un monocultivo o junto con los pericitos y / o los astrocitos en el fin de imitar más de cerca la BBB in vivo ^19-25. En los últimos años, la medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) se ha convertido en una herramienta ampliamente aceptada para evaluar las propiedades de barrera endotelial ^26,27.

TEER refleja la impedancia al flujo de iones a través de la monocapa celular y su disminución proporciona una medida sensible de la integridad de la barrera endotelial en peligro y, por consiguiente aumento de la permeabilidad. Varios sistemas de medida de TEER se han desarrollado, incluyendo epitelial Voltohmmeter (Evom), eléctrica de la célula-sustrato Impedance Sensing (IEM), y el análisis de células en tiempo real ^{15,28 – 30.} TEER refleja la resistencia al flujo de iones entre ECs adyacentes (ruta paracelular) y es directamente proporcional a laintegridad de la barrera. En espectroscopía de impedancia ^27,31, se mide la impedancia total del complejo (Z), que proporciona información adicional acerca de la integridad de la barrera midiendo CCL. Ccl se refiere a la corriente capacitiva a través de la membrana celular (ruta transcelular): la capa de células actúa como un condensador en el circuito eléctrico equivalente, la separación de las cargas en ambos lados de la membrana y es inversamente proporcional a la integridad de la barrera. Cuando se cultiva en insertos permeables, EC se adhieren, proliferan y se extiende sobre la membrana microporosa. Esto se opone a la corriente capacitiva de fondo del inserto (que a su vez actúa como un condensador) y conduce a una disminución de la capacitancia hasta que alcanza su nivel mínimo. Esto es seguido por el establecimiento de TJ complejos que sellar el espacio entre ECs adyacentes. Esto restringe el flujo de iones a través de la ruta paracelular, y TEER aumenta hasta que alcanza su meseta. Bajo condiciones inflamatorias, sin embargo, el endothelial barrera se ve comprometida: TEER disminuye como complejos de conseguir interrumpido TJ y Ccl aumenta a medida que el componente capacitivo de la pieza de inserción se eleva de nuevo.

Nuestra medición TEER utiliza el sistema automatizado de monitoreo de células ^32: se sigue el principio de la espectroscopia de impedancia y se extiende sus aplicaciones anteriores. Aquí, se describe un modelo in vitro en la acreditación que permite el estudio de las propiedades de barrera, incluyendo la interacción de endotelio cerebral con células inmunes; en las células T activadas específicas. Tales condiciones fisiopatológicas se observan en las enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central, tales como la esclerosis múltiple y su modelo animal experimental la encefalomielitis autoinmune ^33-37. Aquí, un paso crucial es la transmigración de las células T encefalitogénicas, específicas para la mielina a través de la barrera hematoencefálica. Esto es seguido por su reactivación en el espacio perivascular y entrada en el parénquima cerebral, donde se reclutan otras células inmunes y mela inflamación y la posterior desmielinización inme- ^1,35,38. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la interacción entre tales células T y las células endoteliales, los principales constituyentes de la BBB, no están bien comprendidos. Nuestro protocolo pretende llenar este vacío y dar nuevos conocimientos sobre las consecuencias sobre las células endoteliales (es decir, integridad de la barrera y permeabilidad) tras su contacto directo y compleja interacción con células T activadas.

El protocolo descrito aquí hace uso de células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón primario, cultivadas como una monocapa en insertos permeables con membranas microporosas. Las células endoteliales son co-cultivadas con células T CD4 ^+, que se pueden pre-activadas policlonal o de una manera específica de antígeno. Co-cultivo de MBMECs con células T pre-activadas, pero no ingenua induce una disminución de la TEER y un aumento en Ccl, que proporciona una medida cuantitativa de la disfunción y la perturbación de la barrera MBMEC. La técnicaes no invasiva: utiliza una función de lugar de electrodos palillos, que impiden importante perturbación de la monocapa CE; que puede ser utilizado para controlar la función de barrera sin el uso de marcadores de células. Se realiza mediciones continuas de forma automatizada y permite una evaluación independiente de los dos parámetros de barrera (TEER y CCL) de forma simultánea en el tiempo. El método también es lo suficientemente sensible para distinguir entre diferentes niveles de activación de las células T y los efectos de tales células T en ECs.

Se puede utilizar en una amplia gama de ensayos funcionales: diferentes citocinas y / o quimiocinas implicadas en los procesos inflamatorios se pueden añadir a la co-cultivo de MBMECs y las células T; bloquea anticuerpos contra moléculas de adhesión celular ya sea en el lado de la CE o de células T se pueden utilizar; e inhibidores de los marcadores de activación de células T o de sus propiedades citolíticas se pueden añadir durante el cebado de células T o de su co-cultivo con ECs. El ensayo también es útil para la transmigración de las células Tensayos, ya que puede servir como un control de calidad de la integridad de la monocapa MBMEC antes de la adición de las células T. Todo esto hace que este método una herramienta versátil y fiable para estudiar la acreditación in vitro, con un enfoque en el efecto de las células T activadas en la integridad de la monocapa CE. Esto es de particular importancia para la comprensión de los mecanismos de la disrupción de la BHE en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes, como la esclerosis múltiple y su modelo animal de EAE, donde las células autorreactivas, encefalitogénicas T cruzan la barrera hematoencefálica y causan inflamación y daño neuronal.