<em> 체외</em> 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점
Summary
Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.
Abstract
Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.
Introduction
3 – 혈액 – 뇌 장벽은 중추 신경계 (CNS) 1 전신 순환을 분리한다. 그것은 세포의 자유 운동과 수용성 분자의 확산을 억제하고 병원체 및 잠재적 유해 물질로부터 뇌를 보호하는 물리적 장벽을 제공한다. 그 장벽 기능에 더하여, BBB는 신경 조직의 적절한 작동을 보장 뇌 실질 조직에 산소와 영양분의 전달을 가능하게한다. BBB를의 기능적 특성은 높은 고도로 전문화되는 EC는 주요 구조 부재 인 상태의 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 조절된다. BBB를되는 EC의 꽉 접합 (TJ) 착체, fenestrations의 부족 pinocytic 매우 낮은 활성 및 완전히 활성 전송 메커니즘의 존재를 특징으로한다. 내피 세포, 성상 세포 엔드 피트 = 관련된 파를 포함 기타 BBB의 구성 요소 EC 기저막, 혈관 주위 세포enchymal 기저막 또한 BBB 2,4의 개발, 유지 보수 및 기능에 기여 – (6)과 함께 뉴런과 마이크로 글 리아와 상기 CNS (7)의 적절한 기능을 가능하게하는 뇌 혈관 부 (NVU) 형성 – 9.
이러한 신경 변성, 염증 또는 감염 질환과 같은 신경 질환의 다양한에서 BBB의 기능을 손상 2,5,10. TJ 복합체 분자 반송기구의 이상 조절은 BBB 침투성 백혈구 혈관 외 유출, 염증 및 신경 손상을 증가하도록 이끈다. 이러한 병태 생리 학적 조건에서 BBB 특성을 연구하기 위해, 다양한 시험 관내 BBB 9,11,12 모델을 확립 하였다. 이들은 장벽 무결성, 투과성뿐만 아니라 전송 메커니즘의 변화에 귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 모델은 인간, 마우스, 쥐, 돼지 또는 b의 내피 세포를 사용양의 기원 13-18; 25 – 기본 내피 세포 또는 세포주 생체 (19)보다 밀접 BBB를 모방하기 위해 혈관 주위 세포 및 / 또는 성상 세포와 단종으로 또는 함께 두 배양한다. 최근 몇 년 동안, transendothelial 전기 저항 (봉사자)의 측정은 내피 차단 성 (26, 27)을 평가하기 위해 널리 허용 도구가되었습니다.
티이은 세포 단층을 가로 질러 이온 플럭스 임피던스를 반영하고 그 감소 손상된 내피 장벽 완전성 따라서 증가 된 투과성 민감한 척도를 제공한다. 30 – 다양한 티이 측정 시스템은 상피 Voltohmmeter (EVOM), 전지 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS), 실시간 세포 분석 15,28 등이 개발되었다. 티이 인접되는 EC의 이온 플럭스 (paracellular 행)에 대한 내성을 반사하고 정비례장벽의 무결성. 임피던스 분광 27,31에서는 복잡한 총 임피던스 (Z)가 CCL을 측정함으로써 배리어의 무결성에 대한 추가 정보를 제공하는 측정된다. CCL은 세포막 (세포 횡단 경로)를 통해 용량 성 전류에 관한 것으로, 셀 층은 막의 양쪽에 전하를 분리하는 등가 전기 회로에 캐패시터와 같은 역할을하고 역 장벽 완전성에 비례한다. 투과성 인서트 상에 성장하면되는 EC가 부착 증식 미다 공막에 걸쳐. 이것은 (자체 커패시터처럼 동작)과 그것의 최소 레벨에 도달 할 때까지, 용량의 감소로 연결 삽입물의 배경 전류 용량 저항. 이것은 TJ의 설립 뒤에 것은 인접되는 EC 사이의 공간 떨어져 그 인감 복합체. 이 paracellular 경로를 통해 이온 플럭스를 제한하고, 그것의 고원에 도달 할 때까지 봉사자는 증가한다. 염증성 조건 하에서, 그러나, endotheli알 배리어가 손상되어 TJ가 방해받을 착물 삽입물의 용량 성 성분이 다시 상승을 CCL 증가로 티이 감소한다.
우리 티이 측정은 자동 세포 모니터링 시스템 (32)을 사용하여 그 임피던스 분광법의 원리를 따르고 이전 어플리케이션을 확장한다. 여기, 우리는 면역 세포와 뇌 내피 세포의 상호 작용을 포함하는 차단 성 연구를 가능하게하는 생체 외 BBB 모델을 설명; 특히 활성화 된 T 세포이다. 37 – 이러한 병태 생리 학적 조건은 다중 경화증 및 동물 모델 실험자가 면역 뇌척수염 (33)와 CNS의자가 면역 질환에서 관찰된다. 여기서, 중요한 단계는 전역 BBB encephalitogenic, 미엘린 특정 T 세포의 윤회이다. 이것은 뇌 실질에 혈관 주위 공간과 항목에서의 재 활성화 뒤에, 그들은 다른 면역 세포를 모집하고 저 곳diate 염증 및 후속 탈수 초화 1,35,38. 그러나, 이러한 T 세포와 내피 세포 간의 상호 작용의 분자 메커니즘은 BBB의 주성분은 잘 이해되지 않는다. 우리의 프로토콜은이 격차를 작성하고 활성화 된 T 세포와의 직접 접촉하고 복잡한 상호 작용에 따라 내피 세포 (즉, 장벽 무결성 및 투자율)의 결과에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 것을 목표로하고있다.
여기에 설명 된 프로토콜은 미세 다공성 멤브레인 투과성 인서트에 단층으로 성장 기본 마우스 뇌 미세 혈관 내피 세포를 사용한다. 내피 세포를 공 배양된다 polyclonally 또는 항원 특이 적 방식으로 어느 사전 – 활성화 될 수있는 CD4 + T 세포와. 활성화 미리 아니지만 나이브 T 세포 MBMECs 공동 배양 티이 감소하고 MBMEC 부전 및 장벽 파괴의 정량적 측정 값을 제공 CCL의 증가를 유도한다. 기술비 침습적이다 : 그것은 내장 대신 EC 단층의 주요 교란을 방지 젓가락 전극의 사용; 세포 마커의 사용없이 장벽 기능을 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 이 자동화 된 방식으로 연속적인 계측을 동시에 시간에 따른 두 개의 장벽 파라미터 (티이 및 CCL)의 독립적 인 평가를 가능하게한다. 상기 방법은 또한 다른 T 세포 활성화의 수준 및 EC를 그러한 T 세포의 효과를 구별 할 정도로 민감하다.
그것은 기능 분석의 넓은 범위에서 사용할 수있다 : 염증 과정에 연루 다른 사이토 카인 및 / 또는 케모카인은 MBMECs 및 T 세포의 공동 배양에 첨가 될 수있다; EC의 또는 T 세포 양측에 세포 부착 분자에 대한 차단 항체를 사용할 수있다; 및 T 세포 활성화 마커 또는 세포 용해 특성의 억제제는 T 세포 프라이밍 또는 내장 컴퓨터와의 공동 – 배양 동안 첨가 될 수있다. 분석은 T 세포 윤회에 유용분석법은 T 세포를 첨가하기 전에 MBMEC 단층 무결성 품질 관리 역할을 할 수있다. 이 모든 것은이 방법을 EC 단층 무결성 활성화 T 세포의 효과에 초점을 시험 관내에서 BBB를 연구하는 다용도 공구를 신뢰할 수있다. 이것은 자기 반응성 encephalitogenic T 세포는 BBB를 통과 염증 및 신경 손상을 일으킬 MS 및 동물 모델 EAE 같은자가 면역 질환의 발병 기전에서 BBB 중단의 메커니즘을 이해하는데 특히 중요하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기술 된 프로토콜의 여러 단계를 성공적으로 실험에 필수적이다. 초기 MBMEC 분리 및 배양 동안, 작업 진균 포자 또는 세균 세포 배양의 오염을 방지하기 위해, 가능한 멸균 조건 하에서 수행하는 것이 중요하다. 내장 컴퓨터의 순수 배양을 얻기 위해서는이되는 EC 생존 가능 제 사흘 퓨로 마이신을 함유하는 배지가 아닌 다른 세포 유형 (특히 혈관 주위 세포) (41, 42)을 사용하도록 권장한다. …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 봉사자 측정에 관한 도움이 토론 아니카 Engbers과 우수한 기술 지원을위한 프랭크 커스 박사 마르쿠스 SCHAFER (nanoAnalytics GmbH의)에 감사하고 있습니다. 이 작품은, HW 및 LK, CRC TR128에 SFB1009 프로젝트 A03는 A08 돌출 독일 연구 협회 (DFG)에 의해 지원되었다; Z1 및 B01는 LK 및 LK에 HW 및 (뮌스터의 의료 학부) 임상 연구를위한 학제 간 센터 허가 번호 KL2 / 14분의 2,015합니다.
Materials
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts – pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
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