Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi
Summary
sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek.
Abstract
The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.
Introduction
Birçok canlı organizma çevreye günlük değişikliklerin etkili müzakere yardımcı olmak için bir endojen hakemi sahiptirler. Bu hakemi, sirkadiyen saat, dış ortamda öngörülebilir değişiklikleri tahmin etmek bir organizmanın metabolizması ve fizyolojisi birçok açıdan düzenler. 4 – örneğin bitkilerde, geçici öngörülebilir patojen veya otobur saldırıları beklentisiyle güçlü genel duyarlılık 1 azaltır. Nişasta metabolizması sıkıca uzun ya da kısa günün şartlarında 5 yetiştirilen olsun sabaha kadar son o nişasta rezervleri sağlamak için sirkadiyen saat düzenlenir. Nitekim, 24 saat çevre gösterisi artan büyüme oranları eşleşen sirkadiyen saatleri ile bitkiler, karbon fiksasyonu oranları ve sağkalım oranları uyumsuz dönemi 6 bir saat çalışan bitkilere kıyasla. Bütün bu süreçlerde sirkadiyen ritim geniş etkisi üçte kadar ritmik düzenlemelerinden büyük ölçüde ortaya çıkarArabidopsis 7 toplam transcriptome. Bu ritmik gen ürünleri metabolik yollar, hormon sinyalizasyon ve stres yanıtları 7 dahil, hücresel süreçlerin geniş bir yelpazede yer alırlar. Bunun üzerine, protein fonksiyonunun doğrudan sirkadiyen düzenleme fosforilasyon 8 sirkadiyen düzenlemesi ve büyük olasılıkla diğer post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) tarafından kurulmuştur.
Bu günlük transkripsiyonel yeniden programlamayı sürücüler sirkadiyen saat merkezinde / öteleme geri besleme sabah ifade genler de dahil olmak üzere (TTFLs), döngüler transkripsiyonal bir ağ yatıyor ifade bastırmak sirkadiyen saat ASSOCIATED 1 (CCA1) ve Geç UZATILMIŞ hipokotil (Lhy) – 11 LUX ARRHYTHMO (LUX), erken çiçek açan 3 (ELF3) ve ELF4 9; akşam genleri CAB 1 (TOC1), gigantea (GI) ve akşam kompleksi (EC) üyelerinin zamanlaması. birlikte zekâH Yalancı TEPKİ REGÜLATÖRÜ -genes (PRR3, 5, 7 ve 9) AT pozitif bir regülatörü 12 olarak görev yapar iken, TOC1 CCA1 / Lhy ekspresyonunu bastıran – 14. TTFL ağ bileşenleri, geri besleme mekanizmaları Ek transkripsiyon sonrası ve post-translasyonel regülasyon ayar sirkadiyen ritimler önemli bir rol oynar. Bugüne kadar, sirkadiyen saat proteinleri tespit en bol PTM fosforilasyonu 15'dir. Kazein Kinaz 2 (CK2) tarafından CCA1 fosforilasyonu onun promotörleri 16 hedef bağlanma ve sirkadiyen saat 17 sıcaklık dengelemesi açısından önemlidir etkiler. PRR proteinleri farklı şekilde sirkadiyen döngüsü boyunca fosforile ve TOC1 fosforilasyonu negatif regülatörü ile etkileşimi etkiler vardır, akşam aşamalı saat bileşeni ZEITLUPE (ztl) 18. Bu örnekler kadar 24 saat içinde PTMS ve protein-protein etkileşimleri ayar TTFL ağıtranskripsiyonel osilatör. Transkripsiyonel saat ağı ve düzenlenmesi için daha detaylı bir giriş için mükemmel son yorumları (örneğin referans 15) bulunmaktadır.
Ancak, ne daha az açık kalır ritmik düzenlenmiş süreçler ve hücresel metabolizma diğer yönleri geri timekeeping mekanizması kendi içine beslemek için derecesidir. Saat kusurları için Arabidopsis mutantlar geniş tarama mekanizmaları ya da sinyal yolları bir TTFL ağdan 24 saat ritimlerin üretiminde rol oynayan edilebileceği ileri anlayışa olabilir. Bu amaçla, Kim ve Somers önce herhangi bir Arabidopsis çizgisi 19 saat fonksiyonu etkin ve hızlı analiz için bir kırılma yoluyla yöntemi yayınladı. protoplast geçici ekspresyonu kullanımına göre, bu yöntem, stabil transgenik kuşaklar için ihtiyaç aşan ya da lüminesan saat markör hatları geçmektedir. Burada, bir yüksek verimli protoplast, izolasyon görselleştirmekoptimize edilmiş bir protokol ile birlikte n yöntemi 20, 96 oyuklu bir plaka okuyucusunda geçici olarak ifade saat belirteçlerin lüminesan görüntüleme sirkadiyen kusurları ekranlanması için kullanıldı.
Biz değişmiş sirkadiyen ritim algılar burada başarılı açıklanan metodoloji onaylamak için iyi karakterize saat mutantlar için yabani tip Koleji'nden 0 Arabidopsis karşılaştırır. LUC 19: CCA1pro; bu hatlar türetilen Protoplastlar sirkadiyen CCA1 promoterinden ateşböceği lusiferazı eksprese eden bir raportör yapısı ile transfekte edilir. Lusiferaz Bu da, bu protoplastlarda genlik, transkripsiyonel ritim faz değerlendirmek için zamanla görüntülendi olan, ışığı 21 yayar oksilusiferin luciferase için elektronik olarak uyarılmış dönüştürüldüğü çok aşamalı reaksiyonu katalize eder.
protokol üç ana bölümden oluşmaktadır; haberci plazmid ve lüminesan IM protoplast transfekte edilmesi, protoplast izolasyonyaşlanma. Bu üç parça, her zaman taze hazırlanmış tamponlar ve reaktifler kullanılarak, tek bir günde yapılmalıdır. Bitki büyümesi ve raportör plasmidinin yeterli miktarda saflaştırılması önceden yapılmalıdır ve bu protokolde görselleştirilemediği.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, protoplast izolasyonu, transfeksiyon ve luminecent görüntüleme dahil olmak üzere Arabidopsis hatlarında sirkadiyen dönem kusurları, ekrana hızlı bir test sunuyoruz. Yabani tip sirkadiyen süresi Arabidopsis ve saatli mutantları cca1 / Lhy, ZTL ve CCA1 OX bir CCA1pro gelen lüminesan ölçümlerinden hesaplandı: LUC raportörünün daha sürülme süresini kullanarak bütün bitkilerde üretilen yayınlanmış verilerle tutarlı olduğu bulunmuştur tüketen transgenik yaklaşımlar (Tablo 2). Arabidopsis mutantlar taranması için Bu tayin kullanılarak, zaman alıcı ve yalnızca belirli bir mutant yabanı ritimleri sergiler ortaya çıkarabilir transjenik lüminesan hatları oluşturmak için ilk şartı önler. Bu protokolün açık bir avantajı, herhangi bir Arabidopsis hat tesislerinde timekeeping etkileyen daha genlerin belirlenmesini yardımcı olacaktır değişmiş sirkadiyen ritimler transkripsiyon, kısa sürede ekranlı olmasıdır.
<p class= "Jove_content"> protoplast izolasyonu mutant hat bodur bir fenotip görüntüler, özellikle zahmetli olabilir. Protoplast üretilmesi için önce bildirilen yöntemlerle enzimler, hücre duvarları 26,27 ulaşmasını sağlamak için enzim solüsyonu ile şeritler infiltre ince şeritler ve vakum yaprakları veya fide kesme içerir. sonraki sindirim enzim çözeltisi içine protoplast serbest bırakmak için karanlıkta en az 3 saat inkübasyon gerektirmektedir. Vakum infiltrasyon uygulanmadığı zaman, 18 saat kadar olan kuluçka süresi tavsiye edilir. enzimlere aşılmaz epidermal hücre tabakası bant çıkarılır, çünkü burada sunulan protokolde, vakum infiltrasyon gereksizdir. bitki materyali keserek protoplast oluştururken sindirim sonra hücre duvarı enkaz ayrı protoplastlar için gereklidir; Bu, genellikle solüsyon filtre veya bir şeker degrade 27,26 üzerinde saflaştırılması yapılır. Burada, herhangi bir sindirilmemiş doku otoklav bandı sonra kalacaksindirim, protoplast filtrasyon ve şeker degrade arıtma atlanabilir böylece. Uzun süreli protoplasting prosedürlerden kaynaklanan stres, hücre canlılığı ve sirkadiyen saat etkileyen bir şans var. Burada görüntülenmiştir bant tabanlı protoplasting yöntemi 20 protoplastlar yüksek sayıda verir; ve sirkadiyen zaman serisi üzerinde hücrelerin canlılığını verildi ve protoplast ve bütün fideleri (Tablo 2) uygun süresi uzunluğu, burada açıklanan yöntem protoplast meydana getirmek için alternatif yöntemleri tercih edilir.protokolün transfeksiyon adımı o protoplast canlılığı üzerindeki etkileri kritik bir adımdır. PEG çözeltisi hücreye taşınması için DNA, ve her iki inkübasyon süresi, bu çözelti içinde (aşama 3.4) ve deneysel olarak tespit edilmelidir PEG yüzdesinin sağlar. standart konsantrasyon dönüşüm verimliliği ve yüksek azaltarak düşük konsantrasyonlarda ile% 20 olduğucanlılığı 28 azaltılması konsantrasyonları. Beş dakika kadar kısa inkübasyon süresi protoplastlar 27 verimli transfeksiyon verim verebilir.
protoplastlar herhangi Işıklı görüntüleme platformu üzerinde görüntülenebilir. Bu videoda, biz yüksek verimli tarama ve sık ölçümler için izin verir, (~ 20 μE kombine yoğunluğu sırasıyla kırmızı ve mavi LED'ler, 630 ve 470 nm,) dış ışıkları ile donatılmış bir parlaklık plaka okuyucu kullandık. aydınlatma fotosentez için kullanılabilir gibi bir şarj çiftli aygıt (CCD) kamera etrafında dayalı alternatif plaka okuyucu veya kurulumları olarak lüminesans algılar diğer görüntüleme ekipmanları, sürece eşit şekilde uygulanabilir. kontrol edilebilen bir kabin üzerine monte edilmiş bir CCD kamerası kullanılarak bir avantajı, hafif ve sıcaklık programlanabilir. Bir dezavantaj perturb ek olarak protoplastlar için strese neden olabilir karanlığın uzun süreli dönemleri tanıtan, uzun yakalama zamanıendojen timekeeping ing. Ne olursa olsun seçilmiş deneysel hangi platformu, ayarları, fide ya da olgun bitkiler için ayarlara göre gerekli olması muhtemeldir. Bizim tecrübelerimize göre, görüntüleme tamponunda transfeksiyonu ve / veya luciferase sırasında raportör plazmid artan konsantrasyonları ilk deneylerde oluşabilecek düzensiz veya hızlı nemlendirme ritimleri çözebilir.
Gelecekteki deneylerde, burada tarif edilen yönteme göre herhangi bir mutant arabidopsis çizgisinin sirkadiyen fenotip çalışma uygulanabilir. Küçük değişiklikler yapılarak, zaman tutma gibi değişik ilaçların etkisi bu kurulum okudu olabilir. Ayrıca, transfeksiyon daha bu protokolün çok yönlülük genişleyen, 19 susturulması gen için yapay microRNA içerecek şekilde modifiye edilebilir. Pirinç protoplast oluşturmak için Protokoller 29 köklü ve burada sunulan görüntüleme protokolü eşit bizim u ilerletmek için uygulanan olabilirekonomik açıdan önemli monokot mahsul bitkilerinde saatin nderstanding.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).
Materials
| CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
| Pectinase R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4503 | |
| MES | Acros Organics | 327765000 | |
| NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
| Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9618 | |
| Comply Steam Indicator Tape | 3M | 1222 | |
| Magic Tape | 3M | 819-1460 | |
| Petri Dishes | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Microplate, 96 well, flat bottom, white | Greiner Bio-One | 655075 | |
| TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates | Perkin Elmer | 6050195 | |
| Syringe, 10 ml, w/o needle | BD Plastipak | 302188 | |
| Syringe filter 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) | Free download at amillar.org | ||
| QIAfilter Maxiprep Kit | Qiagen | 12262 | |
| Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell | Hawksley | AC6000 | |
| Bright field microscope | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
| LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |
Referenzen
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).
- Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).
- Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).
- Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309 (5734), 630-633 (2005).
- Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).
- Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).
- Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).
- Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).
- Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).
- Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).
- Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).
- Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).
- Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
- Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).
- Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).
- Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).
- Wu, F. -. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16 (2009).
- Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4 (3), 223-228 (1996).
- Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).
- Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101 (3), 319-329 (2000).
- Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).
- Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).
- Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).
- Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).
