Medição de<em> In Vitro</em> Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

Replicação de HIV-1 na célula alvo envolve vários passos, agrupadas em duas fases: eventos precoces e tardias. Os eventos iniciais começam quando o HIV-1 liga-se a sequência do receptor de superfície da célula alvo CD4 e um dos dois co-receptores (CCR5 ou CXCR4) ^1. Por conseguinte, o fusível membranas de células com vírus, e a cápside virai (CA) do núcleo é libertado para o citoplasma ^2. O núcleo CA contenha o ARN virai genómico de cadeia simples (ssRNA) e várias proteínas, tanto virais e celulares na origem. As proteínas virais associadas-CA incluem Transcriptase Reversa (RT) e da integrase (IN), duas enzimas que medeiam passos críticos durante eventos precoces da replicação viral. A RT e IN função no contexto de complexos nucleoproteicos, nomeadamente a transcrição reversa Complexo (RTC) e o complexo de pré-integração (PIC), respectivamente ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. As extremidades do genoma viral ssRNA terminal do porto de repetição (R) elementos adjacentes às sequências U5 única (na extremidade 5 ') e U3 (na extremidade 3'). O RTC converte o genoma viral num ssRNA (DS) de cópia de ADN de cadeia dupla (vDNA). Este processo de transcrição reversa também resulta na duplicação das sequências U5 e U3, gerando, assim, repetições terminais longas (LTR) em ambas as extremidades do vDNA ^{7, 8.} Subsequentemente, o EM-associado PIC catalisa duas reacções bioquímicas sequenciais que permitem a integração do vDNA no cromossoma do hospedeiro ^{9, 10, 11.} Em primeiro lugar, no citoplasma, EM multímeros envolver ambas as LTRs ¹² e clivar um dinucleótido de cada uma das extremidades 3 '-terminal. Este processamento de extremidade 3 'gera um grupo hidroxilo em cada extremidade 3' (CA _OH) do vDNA.Em seguida, o PIC trafica para o núcleo, em que utiliza o vDNA CA _OH como um nucleófilo para cortar ambas as cadeias do ADN cromossómico de forma escalonada. Simultaneamente, EM coordenadamente emendas de ambas as extremidades do vDNA para as ligações fosfodiéster que resultam em cadeias opostas do ADN cromossómico. Após este passo de transferência de cadeia, a maquinaria da célula hospedeira remove os dois nucleótidos desemparelhados nas extremidades 5 'do vDNA e repara as consequentes lacunas de cadeia simples na junção do local de integração. Os eventos iniciais, assim, culminar com a criação de uma cópia de DNA integrado (provírus) do HIV-1 genoma. O provírus proporciona um ambiente apropriado para a expressão do gene virai eficiente, o que inicia os eventos posteriores, incluindo a expressão das proteínas codificadas por vírus; montagem do vírus imaturo; e brotação, release, e maturação em viriões infecciosos ^13.

Purificada IN retroviral recombinante é competente pararealizar, in vitro, ambas as atividades de processamento e transferência de cadeia 3'-end em exogenamente fornecido DNA substrato LTR-like. Os estudos bioquímicos usando tais IN recombinante purificada revelaram aspectos críticos da integração vDNA ^{14, 15, 16, 17.} No entanto, ao contrário da infecção natural, esta reacção bioquímica in vitro não suporta integração combinada de ambas as extremidades do ADN substrato para a DNA-alvo. Em contraste, os PICs retrovirais isolados a partir de células infectadas de forma aguda concertadamente integrar ambas as extremidades do vDNA endógena no ADN alvo heterólogo. Isto levou à adopção generalizada e refinamentos subsequentes de ensaios in vitro Integração (IVI) I n usando PICs nativas isoladas.

No primeiro ensaio relatado retroviral IVI, extractos citoplasmáticos de células infectadas com um recombinante de murinoVírus da Leucemia (MLV) que alberga o gene de E. coli supF na sua LTR serviu como fonte de actividade em, e o ADN de um fago lambda mutante defeituoso no crescimento lítico foi fornecido exogenamente como o ADN alvo. A integração bem sucedida do ADN recombinante MLV copiar para o ADN de fago e a expressão consequente supF levou a restauração da capacidade de formação de placas de fagos recombinantes. No entanto, esta estratégia experimental é a integração trabalhoso e medidas de forma indireta. Para lidar com estas advertências, um ensaio de marcação terminal indirecta à base de Southern blot, que quantifica a actividade associada IVI-PIC como uma medida da vDNA endógena exógeno integrado no bacteriófago linearizado phiX174 ADN, foi desenvolvido ^{6, 7, 18.} Embora este método proporciona uma medida directa de eventos de integração, quantidades relativamente elevadas de preparação PIC são necessários, o que continua a ser um desafio técnicoesforço. Para contornar isso, aninhados ensaios baseados em PCR que exigem apenas quantidades modestas de PICs foram desenvolvidos ^{4, 5, 19.}

Neste relatório, nós descrevemos uma versão atualizada de um nested PCR baseado no método in vitro concebido para recapitular a atividade de integração do HIV-1 PIC-mediada que ocorrem durante a infecção natural. Este método utiliza os extractos citoplasmáticos de células alvo de HIV-1-infectadas como uma fonte de actividade PIC endógena, que é medido com um tempo real Polimerase Chain Reaction quantitativa (qPCR). Os procedimentos para isolar PICs e medir suas atividades de integração são adaptados, com modificações, a partir de protocolos publicados pelo laboratório Engelman ^20. Neste método, a actividade de integração associada-PIC é iniciado, fornecendo um ADN alvo exógeno linear ^21, e os produtos de DNA resultantesesta reacção integração são purificados e utilizados como material de partida para a quantificação baseado no PCR subsequente. Na primeira ronda de PCR convencional, as junções de ADN viral-alvo são amplificados utilizando iniciadores apropriados. Na segunda rodada qPCR, primers específicos de LTR são usadas para enriquecer especificamente a população vDNA do primeiro turno produtos de PCR. Por favor, consulte a seção de protocolo para uma descrição detalhada deste método.

Estudos in vitro com PICs retrovirais têm conduzido a avanços significativos na compreensão do mecanismo de integração de ADN retroviral e no desenvolvimento de inibidores de NOS. Com base na recente foco maior sobre mapeamento de HIV-1 sites de integração, determinar o papel dos fatores virais e do hospedeiro na HIV-1 integração e desenvolvimento de novas drogas antivirais para o combate à resistência aos medicamentos, prevemos um aumento do interesse e uso generalizado de ensaios IVI , como o descrito no presente relatório. Este, por sua vez, levará afuturos aperfeiçoamentos no método, diversificando assim o alcance de suas aplicações.