Ölçümü<em> İn Vitro</em> HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği
Summary
This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.
Abstract
HIV-1 kaplama proteinleri sitoplazmaya Viral kapsid (CA) çekirdeğin serbest ardından viral hücre zarı birleşmesine yol açar, hedef hücre yüzeyi üzerinde aynı kökenli reseptörleri girerler. Daha sonra, viral ters transkriptazı (RT), bir adaşı nükleoprotein kompleksinin bir parçası olarak karmaşık Ters Transkripsiyon (RTC), çift iplikçikli bir DNA kopyasını (vDNA) viral tek iplikli RNA genomunu dönüştürür olarak adlandırılır. Bu, başka bir nukleoprotein kompleksinin biyogeneze açar, vDNA ve ilişkili virüs proteinleri ve konak faktörlerinin oluşan ön entegrasyon kompleksi (PIC) olarak adlandırılan. PIC-ilişkili viral integraz (İN), bir geçici ve mekansal olarak düzenlenmiştir, iki aşamalı bir işlemde konak kromozomal DNA içine vDNA entegrasyonunu yönetir. İlk olarak, PIC çekirdeğine trafik işlemlerini sonra, kromozomal DNA içine işlenmiş vDNA entegrasyonunu aracılık ikinci sitoplazmada vDNA 3 'uçları işler ve. PIC izolebunlar, bir eksogen olarak ilave heterolog hedef DNA'ya ilişkili vDNA entegre yetkinliğe sahip olan akut HIV-1 ile enfekte edilmiş hedef hücrelerden in vitro fonksiyonel. Böyle bir PIC tabanlı in vitro entegrasyon tayinlerde anlamlı retroviral entegrasyon mekanik ayrıntılarını ortaya koymayı amaçlayan ve inhibitörleri IN keşfetmek katkıda bulunmuştur. Bu yazıda, izole yerli PIC in vitro entegrasyon aktivitesini ölçmek için iç içe geçmiş bir gerçek zamanlı kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) tabanlı bir strateji benimseyerek güncelleştirilmiş bir HIV-1 PIC tahlil üzerine ayrıntılı.
Introduction
Erken ve geç olayların: hedef hücre içinde, HIV-1 replikasyon genel olarak iki faza gruplanmış birden fazla aşamasını içerir. HİV-1, sırasıyla, hedef hücre yüzeyi reseptörü, CD4 ve iki ko-reseptörleri (CCR5 ya da CXCR4) 1 birine bağlandığı zaman, erken olayları başlar. Sonuç olarak, virüs-hücre membranları sigorta ve viral kapsid (CA), çekirdek sitoplazmaya 2 salınır. CA temel viral ve kaynaklı hücresel hem de viral genomik tek şeritli RNA (ssRNA) ve çeşitli proteinleri içerir. CA-ilişkili viral proteinler ters transkriptaz (RT) ve integraz (İN), viral replikasyon erken olaylan sırasında kritik adımları aracılık iki enzimler bulunmaktadır. RT ve nükleoprotein kompleksleri, yani ters transkripsiyon kompleksi (RTC) ve ön-uyum kompleksi (PIC), sırasıyla, 3, 4, 5 kapsamında işlevin <sup>, 6. '(Sonunda 3'ün at) (sonu ve U3 viral ssRNA genom liman terminal tekrarı (R) 5' ucunda) 'eşsiz dizileri U5 bitişik elemanları biter. RTC çift-şeritli (ds) DNA kopyasını (vDNA) viral ssRNA genomu dönüştürür. Bu ters transkripsiyon işlemi, bu şekilde vDNA 7, 8 her iki ucunda uzun terminal tekrarları (LTR) üretilmesi, U5 ve U3 dizilerinin çoğaltılması ile sonuçlanır. Daha sonra, PIC-ilişkili IN konukçu kromozom 9, 10, 11 içine vDNA entegrasyonunu sağlayan iki sıralı biyokimyasal reaksiyonları katalize eder. İlk olarak, sitoplazmada, multimerler her iki LTR 12 meşgul ve 3'-terminal uçlarının her birinden bir dinükleotid bölmektedir. Bu 3'-uç işleme, her 3'-ucunda vDNA (Ca OH) bir hidroksil grubu oluşturur.Zikzaklı bir şekilde kromozomal DNA'nın her iki kolunu kesmek için bir nükleofil olarak OH vDNA CA; buradaki sonra, PIC çekirdeğe trafik işlemlerini gerçekleştirir. Aynı zamanda, İN koordineli kromozomal DNA karşı sarmalda elde fosfodiester bağlarına vDNA her iki ucunu birleşim yerlerinin. Bu şerit transferi adımından sonra, konak hücre makine entegrasyonu sitenin kavşakta 5 'vDNA uçlarına ve onarım takip eden tek sarmallı boşluklar iki eşleşmemiş nükleotidleri kaldırır. Erken olaylar dolayısıyla HIV-1 genomunun entegre DNA kopyası (provirus) kurulmasıyla sonuçlanacak. Provirüs virüs kodlanmış proteinlerin ekspresyonu dahil olmak üzere, daha sonraki olayları başlattığı etkin viral gen ekspresyonu için uygun bir ortam sağlar; olgunlaşmamış virüs montaj; ve bulaşıcı virionlar 13 içine tomurcuklanma, serbest ve olgunlaşma.
Saflaştırılmış rekombinant retroviral IN yetkili olduğunuin vitro, yürütmek, hem 3'-uç işleme ve iplik aktarma faaliyetleri Eksojen LTR-benzeri DNA ana madde sağladı. Arıtılmış yeniden birleştirici kullanarak biyokimyasal çalışmalar, vDNA entegrasyonu 14, 15, 16, 17 kritik yönleri ortaya koymuştur. Bununla birlikte, doğal enfeksiyon farklı olarak, bu in vitro biyokimyasal reaksiyon, hedef DNA'ya alt-tabaka DNA'nın her iki ucundan ortak entegre desteklemez. Bunun aksine, akut olarak enfekte olan hücrelerden izole retroviral PIC concertedly heterolog hedef DNA'ya endojen vDNA her iki ucunu birleştirmek. Bu izole yerli Pics kullanarak yaygınlaşmasının ve ben n Vitro Entegrasyonu (IVI) deneyleri sonraki iyileştirmelere yol açtı.
İlk olarak retroviral IVI deneyi, bir rekombinant sıçan ile enfekte edilmiş hücrelerden alınan sitoplazmik özler raporBunu LTR E. coli supF genini barındıran Lösemi Virüsü (MLV) aktivite kaynağı ve litik büyüme hatalı dışsal, hedef DNA olarak verilen bir mutan lambda faj DNA olarak görev yaptı. rekombinant DNA MLV Başarılı entegrasyon faj DNA kopyalamak ve supF takip eden ifade rekombinant faj plak oluşturan yeteneğini restorasyonu yol açtı. Bununla birlikte, bu deneysel strateji dolaylı şekilde zahmetli ve önlemler entegrasyondur. Bu uyarılar gidermek için, eksojen doğrusallaştırılmış bakteriyofaj phiX174 DNA'sına entegre endojen vDNA bir ölçüsü olarak, PIC ilişkili IVI aktivitesi nicelleştiren bir Güney benek tabanlı dolaylı uç işaretleme analizi, 18 7, 6 geliştirilmiştir. Bu yöntem entegrasyon olayların doğrudan ölçüsünü verir rağmen, PIC hazırlık nispeten yüksek miktarlarda teknik olarak oldukça zor kalır, gerekligayret. Bu aşmak için, PIC bölgesinin sadece az miktarda gereken iç içe PCR bazlı deneyler, 19 5, 4 geliştirilmiştir.
Bu yazıda güncelleştirilmiş bir sürümünü tanımlayan bir iç içe doğal enfeksiyon sırasında meydana gelen HIV-1 PIC-aracılı entegrasyon faaliyeti özetlemek için tasarlanmış in vitro yöntem PCR tabanlı. Bu yöntem, bir gerçek zamanlı kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) ölçülen endojen PIC aktivite kaynağı olarak, HİV-1 ile enfekte edilmiş hedef hücrelerin sitoplazmik özler kullanılır. Onların entegrasyon faaliyetlerini PICS izole ve ölçmek için prosedürler Engelman laboratuvar 20 tarafından yayınlanan protokollerden, değişikliklerle, adapte edilir. Bu yöntemde PIC ilişkili entegrasyon aktivitesi eksojen bir doğrusal hedef DNA 21 ve elde edilen DNA ürünleri temin edilmesiyle başlatılırBu entegrasyon, reaksiyon saf hale getirilir ve daha sonra, PCR tabanlı bir miktar tayini için başlangıç malzemesi olarak kullanılır. Birinci turda, geleneksel PCR, viral hedef DNA, kavşaklar, uygun primerler kullanılarak yükseltilir. ikinci turda qPCR, LTR-özel primerler, özellikle ilk tur PCR ürünlerinden vDNA popülasyonu ettirecek kullanılır. Bu yöntemin ayrıntılı bir açıklama için protokol bölümüne bakın.
Retroviral PIC ile in vitro çalışmalar retroviral DNA entegrasyon mekanizması anlayışımızda ve IN inhibitörlerinin gelişiminde önemli ilerlemelere yol açmıştır. HIV-1 entegrasyon viral ve konak faktörlerin rolünü belirlemek ve ilaç direncini mücadele yolunda yeni antiviral ilaçlar geliştirmek, haritalama, HIV-1 bütünleşme sitelerinde son artan odak dayanarak, IVI deneylerinin bir artış ilgi ve yaygın kullanımı tasavvur Bu raporda açıklanan gibi. Bu da, yol açacaktıryönteminde gelecek iyileştirmeler, böylece onun uygulamalarının kapsamını çeşitlendirilmesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
retroviral PIC biyokimyasal analizler retroviral DNA entegrasyonu mekanizması içine kritik bilgiler sağladı. Retroviral PIC entegrasyonu faaliyetinin ölçülmesi plak formasyonu deneyi, Güney benek analizi, ve iç içe geçmiş qPCR elde edilebilir. Plak deneyi deneysel strateji zahmetlidir ve entegrasyonu 6, 7, 18 ölçmek için dolaylı bir yöntem kullanmaktadır. Güney benek bazlı deneyler ölçer entegrasyonu doğr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen CD NIDA / NIH hibe DA024558, DA30896, DA033892 ve DA021471 tarafından desteklenmektedir. Biz de RCMI hibe G12MD007586 kabul, Vanderbilt CTSA UL1RR024975 hibe, Meharry Translational Araştırma Merkezi NCRR / NIH, NIMHD / NIH U54 hibe MD007593 ve Tennessee CFAR hibe P30 AI110527 dan (MeTRC) CTSA hibe U54 RR026140.
Materials
|
Fetal bovine serum (FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10437-028 |
|
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10438-026 |
|
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) |
GIBCO/Invitrogen |
11995-065 |
|
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium |
GIBCO/Invitrogen |
11875-093 |
|
Phosphate buffered saline (PBS) (1X) |
GIBCO/Invitrogen |
20012-027 |
|
Trypsin-EDTA (0.25%) |
GIBCO/Invitrogen |
25200-056 |
|
Penicillin-Streptomycin solution (100x) |
Cellgro/Mediatech |
30-002-CI |
|
HEK293T cells (293T) |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-3216 |
|
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
114 |
|
PolyFect transfection reagent |
Qiagen |
301107 |
|
DNase |
Calbiochem/Merckmillipore |
260913 |
|
Immulon 2HB 96-well plates |
Thermo Scientific |
3455 |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
T9284 |
|
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
1513 |
|
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS) |
— |
— |
|
Donor bovine serum |
Gibco/Invitrogen |
16030074 |
|
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use. |
— |
— |
|
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C. |
— |
— |
|
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-) |
Dr. Wesley Sundquist |
— |
|
HIV IgG |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 |
|
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate |
Pierce/ThermoFisher |
31412 |
|
TMB Microwell Peroxidase substrate system |
KPL, Inc. |
50-76-00 |
|
SupT1 cells |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-1942 |
|
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution) |
GIBCO/Invitrogen |
15630-080 |
|
Potassium chloride (KCl) solution |
Sigma-Aldrich |
60142 |
|
Magnesium chloride (MgCl2) solution |
Sigma-Aldrich |
M1028 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Sigma-Aldrich |
43815 |
|
Aprotinin |
Sigma-Aldrich |
A6106 |
|
Digitonin |
Sigma-Aldrich |
D141 |
|
RNase A |
Invitrogen |
12091-021 |
|
Sucrose |
Sigma-Aldrich |
S0389 |
|
phiX174 Replicative Form 1 DNA |
Promega |
D1531 |
|
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
|
|
dNTP mix |
Promega |
U1515 |
|
Go Taq DNA Polymerase |
Promega |
M3005 |
|
Qiaquick gel extraction kit |
Qiagen |
28706 |
|
Ultrapure distilled water |
Invitrogen |
10977-015 |
|
Tris-EDTA (TE) buffer (100X) |
Sigma-Aldrich |
T9285 |
|
Sodium dodecyl sulphate (SDS) |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 |
Sigma-Aldrich |
E7889 |
|
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution) |
Qiagen |
19131 |
|
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA) |
Sigma-Aldrich |
P4557 |
|
Chloroform |
Sigma-Aldrich |
288306 |
|
Glycogen (5 mg/ml solution) |
Ambion/Invitrogen |
AM9510 |
|
Sodium acetate (3M, pH 5.2) |
Sigma-Aldrich |
57899 |
|
Ethanol |
Sigma-Aldrich |
E7023 |
|
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe: 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
iQ Supermix |
Bio-Rad |
170-8862 |
Referenzen
- Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
- Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
- Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).
- Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).
- Hansen, M. S., Smith, G. J., Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro. Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).
- Farnet, C. M., Haseltine, W. A. Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).
- Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54 (4), 497-504 (1988).
- Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356 (1987).
- Lewinski, M. K., Bushman, F. D. Retroviral DNA integration–mechanism and consequences. Adv Genet. 55, 147-181 (2005).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Goff, S. P. Genetics of retroviral integration. Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).
- Panganiban, A. T., Temin, H. M. The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production. Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).
- Bieniasz, P. D. The cell biology of HIV-1 virion genesis. Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).
- Sherman, P. A., Fyfe, J. A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).
- Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).
- Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. A rapid in vitro assay for HIV DNA integration. Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).
- Bushman, F. D., Craigie, R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).
- Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179 (2), 886-889 (1990).
- Engelman, A. Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes. Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).
- Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes. Methods. 47 (4), 283-290 (2009).
- Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients. J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12 (4), 288-293 (1997).
