Fabriceren van afbreekbaar Thermoresponsive Hydrogels op meerdere lengte schalen via reactieve extrusie, Microfluidics, zelf-assemblage en Electrospinning

Wij hebben al deze technieken van de fabricage met succes toegepast op meerdere polymeersystemen met slechts lichte variaties van de methoden beschreven in detail hierboven voor PNIPAM en POEGMA; gebruikers van deze protocollen moet echter bewust van de mogelijke problemen die zich voordoen kunnen wanneer andere polymeren worden vervangen in deze processen. In het bijzonder, verhoging van de viscositeit van de polymeren vallende voorloper kan negatieve gevolgen hebben zowel de processibility (met name in de microfluidic-methode), alsmede de efficiëntie van het mengen van de voorloper van de twee polymeren. Bovendien, moet de gelering tijd van de polymeren vallende worden gecontroleerd tegen een tarief afhankelijk van de morfologie gericht om te voorkomen dat voorbarig gelering dat dient om de stroom te remmen of deze te voorkomen dat interdiffusion van de pre reactieve polymeren, essentieel om de gewenste homogene gel structuren. De specifieke beperkingen van elke strategie, evenals de benaderingen die wij hebben gebruikt aan te passen deze benaderingen om dergelijke beperkingen op elke schaal lengte fabricage worden hieronder beschreven.

Bulk hydrogels via dubbele vat spuit co-extrusie
Gelering tijd is de belangrijkste variabele te controleren om ervoor te zorgen de werkzaamheid van de dubbele vat spuit techniek voor het vormen van bulk hydrogels. Polymeren die gel te snel bij contact ( 5 s zijn voorkeur (hoewel niet verplicht) voor het gebruik van deze techniek; Dit is vooral belangrijk als repliceren hydrogels zijn voor fysieke of mechanische analyse om ervoor te zorgen dat elke hydrogel cast dezelfde samenstelling heeft wordt gegoten. Gelering tijd gemakkelijk kan worden gewijzigd door het veranderen van de dichtheid van reactieve functionele groepen enerzijds of zowel voorloper polymeren (lagere functiegroep dichtheid leidt tot langzamere gelering) of het wijzigen van de concentratie van de polymeren vallende voorloper gebruikt om te vormen van de gel ( lagere concentraties leiden tot tragere gelering)²¹. Afwisselend, ter vervanging van de (reactiever) aldehyde-groep met de (minder reactief) keton-groep als het elektrofiel in de gelerend paar aanzienlijk vermindert de gelering tijd aanzienlijk zonder dat de samenstelling van de resulterende hydrogel³⁵ ; polymeren bereid met mengsels van aldehyde en keton monomeer precursoren kunnen worden gebruikt voor het afstemmen van de gelering tijd zoals gewenst zonder het wijzigen van de concentratie van precursor polymers gebruikt (en dus de massa percentage vaste stof in de resulterende gel gevormd).

We zouden stellen ook vast dat de eerste hydrogel cast niet altijd over dezelfde eigenschappen als latere hydrogels gegoten beschikt, een waarneming die toegeschreven aan kleine verschillen in het tempo waarmee de inhoud van de twee vaten eigenlijk de statische mixer bereiken. Dientengevolge, wij doorgaans de dubbele vat spuit prime door de diepte van een klein (< 0.3 mL) Fractie van gel alvorens aan te vangen van de casting proces om te minimaliseren van dergelijke variabiliteit. Tot slot, terwijl niet meestal problematisch zijn bij het gebruik van oligomere synthetische pre polymeren, de viscositeit van een of meer voorloper Polymeeroplossingen kan vormen een uitdaging in het kader van deze techniek, zowel in termen van het vergemakkelijken van stroom met behulp van eenvoudige duim depressie Naast het bevorderen van effectieve mengen binnen de statische mixer. Echter enigszins verrassend, zelfs voorloper Polymeeroplossingen met sterk verschillende viscositeiten nog altijd vormen relatief homogene hydrogels met behulp van de statische mixer bijlagen wordt beschreven in de lijst van onderdelen (b.v., PNIPAM met een hoog moleculair gewicht koolhydraten²⁶), suggereren dat bezorgdheid omtrent de inefficiënte mengen als gevolg van verkeerd gecompenseerde viscositeiten mogelijk niet significant ten minste op de schaal van de bulk. Indien nodig, kan het gebruik van een spuitpomp (in plaats van de duim) naar station stroom en/of het gebruik van een grotere spoorbreedte naald bij de uitgang helpen overwinnen van kwesties in verband met extrudability in deze systemen.

Microscale hydrogels via reactieve microfluidics
De belangrijkste stap die is gekoppeld aan de aanpak van de microfluidics voor gel microparticle fabricage is de priming van de microfluidics-chip met de twee reactieve polymeren. Als de polymeren worden geleverd met verschillende druk of tegen verschillende tarieven in de chip, het drukverschil de terugvoer van één voorloper polymeeroplossing kan rijden in het reservoir (of op zijn minst naar het reservoir) van het andere voorloper polymeer. Dit resulteert in gelering stroomopwaarts van deeltjesvorming, effectief blokkeren van de stroom en waarvoor derhalve chip verwijdering. De martelende pad bedrukt tussen elke reservoir en het mengen punt creëert een aanzienlijke weerstand tegen terugvoer; zelfs een getrainde operator zal echter af en toe een chip gel voordat een stabiele stroom regeling wordt bereikt. Gebaseerd op onze ervaring, is tussen 1-2 min meestal nodig om te stabiliseren van de stromen na de inleiding van de druppel vorming (na verloop van die tijd relatief polydisperse gel microdeeltjes worden geproduceerd); Indien geen problemen worden waargenomen tijdens de eerste 5-10 minuten van operatie, is het waarschijnlijk dat er enkele uren van ononderbroken monodispers deeltje productie kunnen worden bereikt. Het gebruik van de voorloper van polymeren met een relatief goed matched viscositeiten, alsmede niet-momentane gelering tijden (ten minste > 15 s beter) sterk helpt bij het vermijden van deze problemen en de bevordering van de vorming van stabiele stromen.

Opmerking dat stromen verschillende tarieven variërend van 0.01-0,1 mL/h in de waterfase en 1.1-5,5 mL/h in de olie-fase zijn getest met behulp van deze chip ontwerp, wat leidt tot de fabricage van deeltjes op de groottewaaier van ~ 25-100 µm volgens de shear toegepast op de stroom-focusing junction; sneller debiet gelijkstaan aan hogere schuintrekken en dus kleinere deeltjes^31,32gevormd. Variëren van het debiet olie terwijl het totale waterige debiet laag (~0.03 mL/h, zoals aangehaald in het protocol) bleek te zijn meest efficiënte gel microparticle om grootte te controleren zonder afbreuk te doen aan de monodispersity of de levensduur van het apparaat bij te houden, waren die beide waargenomen leiden tot aanzienlijke afname aan het hogere einde van het genoemde totale waterige debiet. Grotere olie debiet (> 5,5 mL/h) maken kleinere deeltjes zijn mogelijk, maar vergroot het risico van chip delaminatie (een gemeenschappelijke beperking ondervonden met plasma-gebonden PDMS microfluidic chips). Verlijmen van de chips met een andere methode kunnen sneller stroomsnelheid en dus kleinere gel microparticle productie, een strategie die we momenteel aan het verkennen zijn. Het verkleinen van de verstuiver kan ook helpen om de grootte van de deeltjes die zou kunnen worden geproduceerd, zij het op een verhoogd risico van voortijdige gelering vóór deeltjesvorming. Langzamer debiet de neiging om te leiden tot stromen van instabiliteit en dus hogere polydispersiteit en een verhoogd risico op chip gelering; Deze beperking kan worden overwonnen met behulp van een meerkanaals microfluidic control-stroomsysteem met hogere stabiliteit en hogere resolutie dan de standaard injectiespuit pompen gebruikt in dit protocol.

De keuze van de olie was cruciaal voor het succes van dit protocol, als zwaardere olie (gunstig in termen van preventie gel microparticle agglomeratie na collectie) leidde tot veel minder consequent deeltjesvorming op de verstuiver dan de lichte siliconenolie gemeld het protocol. We veronderstellen dat dit verlaagd reproduceerbaarheid is een gevolg van lagere consistentie van de injectiespuit pompen van zwaardere olie, wat leidt tot meer variabele schuintrekken op het mengen punt. Vermijden van gel microparticle aggregatie in de collectie kolf was ook een uitdaging, met name onmiddellijk bij de uitgang van het apparaat van de microfluidic op welk punt in situ gelering niet volledig en grote aantallen beschikbaar reactieve was functionele groepen waren beschikbaar voor formulier bruggen tussen botsende deeltjes in het bad collectie. Deze uitdaging is gericht door: verhoging van de lengte van het kanaal van de afrit op de microfluidic-chip zelf, de gel microdeeltjes in laminaire flow wordt gehandhaafd voor een langere periode van tijd te bevorderen vollediger gelering; de kant-kanalen toevoegen na het mondstuk te voeden meer olie in de chip en dus beter separaat de gel microdeeltjes in deze post mengen kanaal zonder de shear velden op de verstuiver zelf of de productieomvang deeltjes; en een magnetische mixer toe te voegen aan de collectie maatkolf om te voorkomen dat gel microparticle sedimentatie en handhaven van een grotere gemiddelde scheiding tussen aangrenzende deeltjes. Terwijl erg traag gelerend polymeren zou waarschijnlijk verbeteren van de stabiliteit van het apparaat en het minimaliseren van de problemen met priming, werden dergelijke systemen ook waargenomen aanzienlijk verhogen het risico van gel microparticle aggregatie, als een groter aantal reactieve functionele groepen blijft spoorverontreiniging (en dus kunnen formulier Inter deeltje bruggen) over een langere periode van tijd. Als zodanig, gelering keer over de volgorde van 15-60 s lijken te zijn optimaal voor deze techniek: traag genoeg om priming maar snel genoeg om de meest reactieve functionele groepen worden verbruikt vóór de gel microdeeltjes verlaten van het kanaal van de laminaire flow in de collectie kolf.

Verwijdering van de templating olie is ten slotte essentieel om te zorgen dat de daaruit voortvloeiende deeltjes behouden dat de slimme eigenschappen verwacht op basis van de samenstelling van de pre-polymeren toegevoegd en gebruik van deze deeltjes in een biomedische context inschakelen. Het pentaan wassen beschreven procedure was zeer effectief in dit opzicht voor algemene gel microparticle productie. De toepassing van deze techniek in een directe biomedische context (bijv, op de chip cel inkapseling) zou echter herbeoordeling van dit protocol. We hebben ook het gebruik van olijfolie, voorgesteld als dat een meer inerte olie in het kader van contact met cellen³⁶, als het dispergeermiddel onderzocht. Terwijl deeltjesvorming mogelijk was, waren de gel microparticle bevolking aanzienlijk meer polydisperse dan met minerale olie, althans met de huidige chip ontwerp kan worden bereikt. Dus, hoewel de chip lijkt te worden aangepast aan zowel synthetische polymeren en natuurlijke polymeer gel microparticle vorming³¹, een aangepast ontwerp kan worden verlangd om te exploiteren deze techniek meer in het algemeen over alle mogelijke materiële combinaties.

Nanoschaal hydrogels via reactieve zelf-assemblage
Nanogels hebben gevormd met behulp van een zeer breed scala van voorwaarden, met inbegrip van verschillende concentraties van zaad polymeer verwerking (0.5-2 wt %), verschillende ratio’s van crosslinking:seed polymeer (0,05-0,2), verschillende temperaturen (40-80 ° C), verschillende snelheden () mengen 200-800 rpm), en verschillende verwarming tijden na de toevoeging van de crosslinker polymeer (2-60 min)²⁸. In termen van concentraties zijn de waargenomen trends in het algemeen zou worden voorspeld, omdat hogere concentraties van zaad polymeer tot grotere nanogels leiden en hogere ratio’s van crosslinker:seed polymeer leiden tot nanogels met hogere dwarslijn dichtheden en dus lagere thermoresponsivities. Benadrukt moet worden dat de verhoging van het zaad-polymeer concentratie te hoog uiteindelijk leidt tot samenvoeging in tegenstelling tot nanoaggregation, consistent met wat is waargenomen in de conventionele vrije radicalen neerslag proces voor de vorming van bulk thermoresponsive nanogels³. Kortere verwarming tijden werden ook gevonden te zijn gunstig voor kleinere vormen en meer monodispers deeltjes. We veronderstellen dat bedrijf de nanoaggregate langer tijde bij een temperatuur boven de LCST een of beide van de polymeren vallende voorloper verhoogt de kans op aggregatie op nanogel de botsing, met de toegenomen hydrophobicity van de obligatie hydrazon ten opzichte ofwel de voorloper aldehyde of hydrazide functionele groepen waardoor deze aggregatie meer waarschijnlijk zoals de mate van crosslinking bereikt wordt verhoogd. Uiteindelijk, kortere verwarming tijden zijn gunstig vanuit het perspectief van een proces, zoals een monodispers nanogel bevolking kan worden gevormd in minder dan 2 min na crosslinker polymeer toevoeging; 10 min bleek te zijn de langste tijd die consequent monodispers nanogels terwijl ook voor de productie van meer hoogst kruisverwijzende nanogels kon produceren. De methode is interessant, opmerkelijk ongevoelig voor het mengen, met bijna identieke deeltjesgrootte en deeltje grootte uitkeringen als gevolg van mengen op verschillende snelheden, of zelfs het schalen van het proces van grotere volumes. Hoewel in eerste instantie verrast door dit resultaat, spreekt het waarschijnlijk aan de primaire rol van de thermodynamica bij het reguleren van productie van de nanogel.

Om te bereiken lage polydispersiteit, lijken de colloïdale stabiliteit en de mate van hydratatie van de nanoaggregate de belangrijkste variabelen. Bijvoorbeeld, leiden nanoaggregates opgesteld op basis van de meer hydrofiele polymeren vallende hydrazide-matiemaatschappij als de zaad in tegenstelling tot de minder hydrofiele polymeren vallende aldehyde-matiemaatschappij tot nanogels met aanzienlijk lager polydispersiteit. Het verschil tussen de temperatuur van de experimentele vergadering en de LCST van het zaad-polymeer is ook cruciaal. Bij een temperatuur net boven het zaad polymeer LCST ((T-LCST) < 5 ° C) biedt de hoogste kans op de vorming van de nanogel van de monodispers; die ruim boven de LCST creëert meer hydrofobe en samengevouwen nanoaggregates die vaker tot statistische en minder waarschijnlijk naar dwarslijn, terwijl de bedrijfslasten onder de resultaten van de LCST in een relatief niet-compacte zaad polymeer dat niet effectief zijn of reproducibly kruisverwijzende. Voor de beste voorspelling van deeltje monodispersity, het is raadzaam eerst het uitvoeren van een scan UV/vis voor het meten van het begin van de LCST van het zaad-polymeer en vervolgens de zelf-assemblage proces uitvoeren bij een temperatuur van 1-2 ° C boven dat LCST.

Merk op dat nanogels geproduceerd met behulp van deze methode kan worden gelyofiliseerde vorm en redispersed zonder enige verandering in colloïdale stabiliteit, vaak niet mogelijk voor zelf geassembleerde structuren en volgens ons te wijten aan onze crosslinking stabilisatie methode. Wij verwachten ook dat alleen het zaad polymeer dient te worden thermoresponsive deze methode werkt; gebruik van polymeren die ofwel niet-reagerende of reageren op andere stimuli dwarsbinding kan de ultieme toepasselijkheid van deze techniek verder verbreden. Tot slot, aangezien het mengen van de twee de voorloper van de reactieve polymeren is in dit geval passief in tegenstelling tot actieve, gelering tijd is veel minder belangrijk in termen van de procesbeheersing ten opzichte van de andere fabricage strategieën beschreven. Echter, zelfs in deze techniek, houden de totale crosslinking tijd < 30 min is het wenselijk om te minimaliseren van het risico van deeltje aggregatie.

Nanofibrous hydrogels via reactieve electrospinning
Beheersing van de gelering tijd van de reactieve polymeren vallende pre is weer essentieel voor het succes van de gel nanofiber productie. In het bijzonder, ongeveer overeenkomen met de verblijftijd van de polymeren vallende voorloper in de statische mixer (gecontroleerd door het veranderen van het debiet van de oplossing van de dubbele vat spuit, evenals de lengte en de tortuosity van de statische mixer) met de bulk gelering tijd van de polymeren vallende voorloper is essentieel zowel voor behoud van spinnability, alsmede het zorgen voor doeltreffende crosslinking van de gesponnen vezels tussen de naald en de verzamelaar. Sneller gelering leidt tot een ineffectieve Taylor kegel ontwikkeling en dus de arme spinnability, terwijl de langzamere gelering resultaten in een waterige oplossing in plaats van een gel het raken van de verzamelaar, wat resulteert in de verspreiding en de uiteindelijke vorming van een dunne film in plaats van gel nanofibers. Arbeidstijd residentie tijde iets hieronder de bulk gelering is ook gevonden effectief (en inderdaad beter om het risico van verstopping van de naald) Aangezien de verdamping van het water als de oplossing wordt gesponnen effectief concentreert zich de voorloper polymeren vallende binnen de streamen en versnelt dus gelering kinetiek tijdens het spinnen. In deze zelfde ader, die op hogere naald-naar-verzamelaar afstanden (> 10 cm) is over het algemeen gunstig in dit proces, zoals kortere afstanden minder tijd beschikbaar voor verdamping van het water en zo nodig strengere controle over de relatie tussen verblijftijd en gelering tijd om de houdbaarheid van een product van nanofibrous.

Merk op dat het gebruik van PEO (of een ander ultrahoog moleculair gewicht en eenvoudig electrospun polymeer) is van essentieel belang in dit protocol ter bevordering van de vorming van de nanofiber, zoals de korte en zeer vertakte POEGMA oligomeren niet alleen het bereiken van een voldoende mate van entanglement ertoe electrospinning; electrospray resultaten verwerken in plaats daarvan op alle voorwaarden getest voor alleen-POEGMA formuleringen (hoewel dit ook toepassingen wellicht voor het maken van afbreekbare gel deeltjes met behulp van deze dezelfde chemie). Een minimumconcentratie van de PEO van 1% van de wt (1 MDa molecuulgewicht) is vereist om een volledig nanofibrous morfologie. Merk op dat de PEO kan worden verwijderd uit de vezels die na een eenvoudige inweken procedure (gedeïoniseerd water, 24-uurs) zonder het verstoren van de integriteit van het netwerk van nanofibrous; op deze manier fungeert PEO meer als een voorbijgaande electrospinning steun dan een essentieel onderdeel van het definitieve nanofibrous product. Merk ook op dat verschillende soorten verzamelaars, met inbegrip van eenvoudige aluminiumfolie (om dunne laag hydrogels die kan delamineren maken van de verzamelaar bij inweken) evenals een roterende aluminium schijf (voor dikker steigers) kunnen worden gebruikt in combinatie met deze zelfde techniek, verstrekt de andere procesvariabelen beheersing van het tarief van gelering, het tarief van electrospinning en het tempo van de verdamping van het water tijdens electrospinning ongewijzigd blijven.

Interessant, afhankelijk van de gebruikte methode voor het bereiden van de verschillende morphologies, significante verschillen waargenomen in de tijden van de afbraak van de hydrogels bereid uit de dezelfde hydrogel precursoren. Bijvoorbeeld, degraderen POEGMA nanofibrous hydrogels langzamer dan bulk POEGMA hydrogels met dezelfde samenstelling ondanks hun aanzienlijk hogere oppervlakte en dus toegang tot water te hydrolyseren het hydrazon obligaties. We hebben betrekking op deze verschillen met de inherente contrasten tussen de beschreven protocollen in termen van de geometrie van het mengen van de voorloper van polymeren, hetgeen tot interne gel homogeneities leiden kunnen en/of morphologies die aanzienlijk verschillen en/of de in situ concentratie van polymere precursors op dezelfde tijdschaal als gelering, bijzonder relevant in electrospinning als gevolg van de gelijktijdige water verdamping en crosslinking waargenomen in dit proces. Terwijl dit de keuze van de polymeren vallende voorloper enigszins compliceren kan als één polymeer voor gebruik in elk protocol is gericht, kan het ook een technische kans in termen van het maken van de hydrogels met een chemische samenstelling, maar zeer verschillende fysische eigenschappen bieden.

Over het geheel genomen de methoden beschreven bieden een strategie voor het fabriceren van afbreekbaar (of ten minste renally clearable) analogen van thermoresponsive polymeren op meerdere lengte schalen (bulk, micro en nano) en met verschillende soorten interne structuren (deeltjes of vezels). Dergelijke protocollen pakken de belangrijkste belemmeringen voor de succesvolle vertaling van synthetische thermoresponsive conventioneel bereid materialen naar het biomedische veld: injectiecapaciteit en afbreekbaarheid. Wij blijven onderzoeken van de toepassing van dergelijk materiaal in zowel drug delivery en weefsel technische toepassingen variërend van de fysieke targeting op kankers, het vervoer van drugs over de bloed – hersen barrière, de therapeutische levering van eiwitten op de achterkant van het oog, de directionele groei van weefsels, en de thermoreversible hechting en differentiatie van cellen, onder andere toepassingen.