の応用<em>インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の>機能テスト

すべての動物を人道的に処理し、すべてのプロトコルがバージニアIACUCの大学によって承認されました。 1.機器の準備すべてのマシンが正しく接続されていることを確認してください。 ハイパワーバイフェーズ刺激とデュアルモードレバーシステムに続いて、コンピュータの電源を入れます。 このとき、2％イソフルランで麻酔供給室に動物を配置し、プラットフォームを37℃に加熱するように加熱素子をオン。 ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）コーティングされた先端が水没され、デバイスとソフトウェアの設定中に消毒されるように70％エタノールに電極を配置します。 見つけて、デスクトップ上のレバーシステム制御ソフトウェアを開きます。 注：これは、機能テストを実行するのに必要なソフトウェアとなります。 2.ソフトウェアのセットアッププログラムは、（ 図1A）が開放されると、パラメータを変更します所望の値に設定メニューの下のインスタントスティミュラスのための。 注：このプロトコルでは、すべてのパラメータが180秒（ 図1B）に変更され、「ファイル名を指定して実行時間（s）」は例外で、予め設定された水準にとどまります。 セットアップメニューの下の自動保存フォルダを作成します。 「自動保存ベース」と表示された型可能なウィンドウの位置を確認します。入力サンプルの名前、例えば「RAT1-日付時点」。直接「自動保存ベース」型可能なウィンドウの左側に、するボックスをクリックし、「自動保存を有効にします。」 コントロール画面の上部には、「シーケンサ」を選択します。新しいウィンドウが開きます。新しいウィンドウの下部に、「オープンシーケンス」を選択します。新しいウィンドウが開きます。既成のシーケンスを選択し、[OK]をクリックします。シーケンスエディタ（ 図1C）：周波数、刺激の持続時間、および残り時間を含むシーケンスパラメータとプロトコルのリストは、名前付きウィンドウに開発します。 「ロード・シーケンス」をクリックしてください – >＆＃34;ウィンドウを閉じます」。 リアルタイム電流と刺激を表示するには、「ファイル」を選択 – >「ライブデータモニタ」。新しいウィンドウが開きます。 新しいライブデータウィンドウ、オートスケール機能を使用して、テスト用のフォーマット画面、または手動で画面に表示される最大値と最小y値を入力します。 3.動物セットアップ注：すべての力の測定値は、11週齢のルイスラットのものです。筋肉量と（ニュートン）の力の生産との間に線形相関があります。したがって、ラットの増加の時代のように、脚部によって生成される力の値も同様に増加するはずです。 動物が麻酔室から取り出す前に、麻酔の適切な平面内にあることを確認してください。完全に電気バリカンを用いた実験脚の足首と骨盤の間に横側の全ての毛を削除します。 注：麻酔の適切な面が達成されたときに、動物の私つま先のピンチに応答しませんよ。各機関の動物実験委員会によって出すガイドラインに従うことが必要です。 それは麻酔の十分な深さのままので、動物の鼻は確実に麻酔ノーズコーン内で確保し、仰臥位で動物を置きます。 三つの独立のノブ（ 図2）により、ペダル装置の位置を調節します。ノブ（A及びB）を使用して、フットペダルを調整し、それぞれ、その左端と最も低い位置にペダル装置を配置します。後で操作のための余地を残しながら、これは、動物の足の正確な位置決めを可能にします。この位置では、動物の足がまっすぐ平面上に位置するように向かって、またはさらに離れ実験者からのいずれかの装置を移動させるためにトラックの左側のノブを使用しています。 ヨウ素とアルコールの3変化で脚をきれいにしてください。ヨウ素は、30秒間の足に残っている必要があります。 動物またはプラットフォームを調整します（ 図2A、D）、拡張足は足の裏とフットペダル間の完全な接触を確保するようにします。 医療用テープを使用して、フットプレート（ 図2D）に対する動物の足を確保します。かかとがペダルの下部にぴったりで、足全体が平坦であり、テスト中にプレートから外れるないことが重要です。 足を安定させるためのクランプ機構の位置を確認します。六角レンチを回して、脚の動きを減少させ、所定の位置にロックする十分で安定化ピンを押してください。 この位置では、向かってまたは離れ実験者からの直線（ 図2C）で足首、脛骨、大腿骨の嘘ように、いずれかの装置を移動させるために、ノブCを使用します。足がフットペダルと平行であることを確認してください。足と脛骨が90°の位置にあるので、ゆっくりと足首を移動するには、もちろん、装置の背面に記載されてい微ノブに調整してください。 Continuそのように、大腿骨および脛骨の足を移動する電子は、90度の垂直角度（ 図2B）です。この時点で、動物は、電極の準備ができています。 電極の4配置 「インスタントスティミュラス」と表示されたオレンジ色のボタンをクリックして、「インスタントスティミュラス」を有効にします。 前脛骨の近位端に表面的に両電極を配置し、スパイクは、ライブモニターに見られるまで、周りの電極チップを移動します。理想的には、スパイクは約0.4 N.すべきです注：電極が順番に、膝と脛骨に対して垂直から横方向に実行されます腓骨神経の面に隣接して直交配置する必要があります。 ピアス真皮に十分、とかろうじて筋層に一方の針を挿入します。スパイクは0.6 N.挿入針の周りのライブモニターに見られるまで、周りの他の電極を移動し、趣味のクランプや医療用テープを使用して所定の位置にそれらをクランプ。 A最大の力出力を見つけるためdjust粗微調整。 ハイパワーバイフェーズ刺激では、中心部の2つのノブがあります。一つは「RANGE」と表示されたもう一方は「ADJUST」されています。所望の最大アンペア数に「RANGE」ノブを回します。 注：ピークが徐々に大きさが大きくなり、最大アンペア数は、3つの連続した刺激が同一の収縮応答を生じるするレベルとして決定されます。必要以上に高いアンペア数を回すレジスト。最大アンペア数は、契約に全体の筋肉を刺激しますが、任意のより高い電流は、同様に筋肉や潜在的アンタゴニスト隣接の募集になります。 筋肉を刺激するために使用される「RANGE」の割合を設定するには、「ADJUST」ノブを回します。この時点で、力は約1.0 Nでお読みくださいこれは、電流の増加または減少を必要とするかもしれません。 彼らが安全であることを確認するために、電極を再確認してください。やめるインスタントスティミュラス。 「ライブデータ」ウィンドウで、「シーケンスを開始します。」をクリックしますバックコントロール画面に行くと、オレンジ色の「インスタントスティミュラス」ボタンの上に位置する「分析」ボタンをクリックすることで、曲線を監視し続けます。強縮曲線は、60 Hzの刺激の周りに形を取り始めるべきです。 5.刺激とクリーンアップを仕上げシーケンスが完了した後、電極を除去し、70％アルコールで拭いてください。カバーに電極を配置します。 膝のクランプを外すと、麻酔をオフにします。麻酔ガスから動物を削除し、加熱パッド上まだ、腹臥位で動物を配置します。イソフルランガスが酸素ラットを保つためにオフにされた後、数分間100％O 2にラットを維持します。動物は、最初に移動することができるが、動物が意識を取り戻すまで戻ってケージに動物を返しません。筋肉痛が注目されている場合あなたの動物管理委員会によって指定されるように、回復時に、NSAIDの用量が与えられるべきです。 ステップ1.2に記載されているすべての機器の電源をオフにし、ソフトウェアを終了し、データ分析に進みます。 プラットフォームとフットペダルを拭いてください。 6.データ解析注：データ分析は、このラボによって設計され、ラボのプロトコルに従ってシーケンスに合わせて行われます。分析値、重要度のデータ点、および手順の他の態様は、ユーザの意図に応じて変化します。 データ解析ソフトウェアを開きます。 一度に複数のデータファイル（サンプル）の分析を可能にするために高スループットのメニューをクリックします。 「強制頻度」の分析を選択します。 「ファイルを選択してください」ボタンをクリックし、必要な数保存したデータファイルを開きます。 カーソル配置手法ボックスで「手動」を選択します。 注：これにより、ユーザは、DATの全てを分析することを可能にします自動的にプログラムとは対照的に、所望のタイムスタンプ、内の分析位置を選択します。 2.に終了カーソルタイムスタンプ値を変更し、「分析」ボタン（ 図1D）をクリックします。 テーブルを保存し、スプレッドシートを使用してデータを分析し、ボタンをACSIIする「テーブルの保存をクリックする。これにより、ファイルが保存されます、それは後でスプレッドシートで開くことができます。 スプレッドシートで保存されたデータファイルを開きます。 「絶対最大」と表示された追加の列を作成し、ベースラインと、各サンプルの最大値の差を決定します。これは、各周波数で生成合計最大の力を提供します。 トルクを決定するために、レバーアームの長さによって、各力の値を掛けます。 注：この場合には、動物の足の長さで表されることになります。このプロトコルは、30ミリメートルの平均実験的に決定された値を使用しています。ユーザーは今ミリアンペアの値を決定しました各周波数で生成ximumトルク。 トルク周波数曲線、または、すべての刺激周波数を横切る動物によって産生さ最大トルクとして、これらの値をグラフ化。 注：これは、サンプル間の比較の一点として特定し、使用することができます。