Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA's Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Een beperking van de huidige HIV-1 behandelingen is dat ze chronisch moeten worden toegediend aan progressie van de ziekte te voorkomen. Transplantatie van HIV-1 resistent T-lymfocyt of hematopoietische stamcellen, heeft het potentieel om lange termijn controle van HIV-1 replicatie verschaffen bij afwezigheid van de therapie ^1,2 en kan ook een effectieve aanpak van een HIV-1 behandeling te bereiken ^3. Een manier om cellen resistent tegen HIV-1 replicatie render dient een of meer genen die coderen voor anti-HIV-1 RNA of peptiden in cellen van een geïnfecteerd individu plaatst tijdens een autologe transplantatie ^4. Sommige kandidaat anti-HIV-1-genen zijn ontworpen met een aantal invoeren klinische proeven in combinaties van twee of ⁵ drie ^6, de ontwikkeling van HIV-1 resistentie voorkomen dat een enkel gen.

Anti-HIV-1 RNA tot de top kandidaten voor combinatie gentherapie vanwege hun lage potentie tot immuunreacties en omdatgetranscribeerd vanaf zeer korte gensequenties. Sommige anti-HIV-1 RNA's zijn ontworpen om virale binnenkomst en integratie targeten. De meeste anti-HIV-1 RNA doelwit na integratiestappen in de virale levenscyclus (figuur 1). Na integratie remmers omvatten helper-RNA's, gericht op de HIV-1 regulerende eiwitten Tat of Rev ^1, en ​​antisense-RNA gebaseerde, gericht is op verschillende plaatsen in HIV-1 RNA, zoals ribozymen ^7, shRNAs ⁸ en ⁹ U1i RNAs. Werkwijzen die zijn gebruikt om de effectiviteit van anti-HIV-1 RNA te vergelijken onder controle virale replicatie in cellen getransduceerd met genen coderend voor kandidaat RNA's en het meten van virusproductie in cellen tijdelijk getransfecteerd met plasmiden die kandidaat RNA en HIV-1 expressieplasmide ^{10 -13.} We hebben voorheen een HIV-1-productie-assay voor het screenen van HIV-1 RNA naar nieuwe ribozyme doelplaatsen ^13-15. Deze methoden zijn inmiddels verfijnd om het formaat van een RNA te optimalisereninterferentie molecuul tot expressie gebracht uit plasmide-DNA als een shRNA of geleverd als synthetische siRNA ^16. De test meet de productie van rijpe virussen uit humane embryonale nier (HEK) 293T cellen, en kan worden gebruikt om de effecten van remmers die post-integratiestappen in de HIV-1 replicatie cyclus targeten (figuur 1) te vergelijken. Voor remmers die pre-integratiestappen targeten, worden alternatieve assays zoals TZM-bl infectiviteit cell assay ¹⁷ nodig antivirale werkzaamheid te evalueren.

Belangrijke veiligheidsproblemen voor de afgifte van anti-HIV-1 RNA in de kliniek onder potentiële off-target effecten op de RNA of eiwitten, en activering van aangeboren immuunsysteem sensoren. Om de toxiciteit van anti-HIV-1 siRNA evalueren, hebben wij een cellevensvatbaarheid assay verschillende cellijnen ¹⁶ gebruikt. Ook gemeten activatie van het dubbelstrengs RNA immune sensoren, RNA geactiveerd proteïne kinase R (PKR) en toll-like receptor 3 (TLR3), alsmede expression van de interferon-geïnduceerde gen, ADAR1 P150. Deze testen kunnen worden gebruikt om te bevestigen dat de werkzaamheid van anti-HIV-1 RNA's niet door indirecte effecten op cellevensvatbaarheid of immuun activering sensor. Ze zijn ook bruikbaar bij het uitsluiten van kandidaat RNA met potentiële toxiciteiten verdere ontwikkeling.

In de volgende protocollen, procedures nieuwe therapeutische RNAs identificeren en optimaliseren van de vorm van bestaande beschreven. De werkwijzen zijn bruikbaar voor het screenen op RNA gebaseerde na integratie remmers van HIV-1 replicatie en kunnen worden aangepast aan andere post-integratie remmers, zoals kleine moleculen gericht op Rev gemedieerde uitvoer van viraal RNA ¹⁸ of CRISPR scherm / Cas systemen die gericht geïntegreerd HIV-1-DNA ^19.