This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
В данной работе протокол для быстрого и стандартизированного обогащения лейкоцитов из небольших образцов цельной крови описана. Эта процедура основана на гипотонического лизиса эритроцитов и может быть применен к человеческому образцов, а также в крови нечеловеческого происхождения. Небольшой начальный объем пробы от около 50 до 100 мкл делает этот метод применим к рецидиву забора крови из мелких лабораторных животных. Кроме того, обогащение лейкоцитов достигается в течение нескольких минут и с низкими усилиями материалов, касающихся химических веществ и приборов, что делает этот метод применяется в нескольких лабораторных условиях.
Унифицированная очистка лейкоцитов в сочетании с высокой селективностью методом окрашивания для оценки галогенирующего пероксидазной активности гема пероксидаз, миелопероксидазы (МРО) и эозинофилов пероксидазы (ЕРО), т.е. образованием хлорноватистой и бромноватистой кислоты (HOCl и HOBr). В то время как MPO сильно выражен в NEUTrophils, самый распространенный тип клеток иммунной в крови человека, а также в моноцитах, соответствующий фермент ЭПО экспрессируется исключительно в эозинофилов. Галоидирующим активность этих ферментов решается с помощью почти HOCl- и HOBr специфичную аминофенил краситель флуоресцеин (ФПА) и первичный пероксидазы пероксид водорода субстрата. При последующем анализе проточной цитометрии все пероксидаза-положительных клеток (нейтрофилы, моноциты, эозинофилы) различимы, и их активность пероксидазы галогенирующего может быть определена количественно. Так как ПФА окрашивание можно комбинировать с применением маркеров клеточной поверхности, этот протокол может быть расширен, чтобы конкретно рассмотреть лейкоцитов подфракций. Метод применим для обнаружения HOCl и HOBr производства как в человеке и в грызунах лейкоцитах.
Учитывая широко и разнообразно обсудили иммунологическая роль этих ферментных препаратов при хронических воспалительных заболеваниях, этот протокол может способствовать лучшему пониманиюиммунологическая значимость лейкоцитарного происхождения гем пероксидазы.
Полиморфно – ядерных лейкоцитов (PMNs, называемые также гранулоциты) и моноциты представляют собой важные клеточные компоненты врожденной иммунной системы в 1,2 крови. Они способствуют лучшей защиты от патогенных микроорганизмов, а также к активации приобретенной иммунной системы и инициирования системного воспалительного ответа 2-4. Тем не менее , особенно нейтрофилы, наиболее распространенный тип гранулоцитов и моноцитов также вносят значительный вклад в регуляции и прекращения острых воспалительных явлений 5. Таким образом , эти клетки могут также играть важную роль в хронических воспалительных заболеваний , таких как ревматоидный артрит 6,7. На самом деле, астма, хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, характеризуется нарушением апоптоза эозинофилов, второй наиболее гранулоцитов типа в крови 8. Тем не менее, апоптозом гранулоцитов и их быстрое удаление макрофагами два основных шага в процессе клеточного прекращениявоспаления 9-11.
В названных иммунных клеток два тесно связанных ферментов, а именно миелопероксидазы (МРО, нейтрофилы и моноциты) и эозинофилов пероксидазы (ЕРО, эозинофилов) можно найти 12,13. Эти гем пероксидазы классически связаны с гуморального иммунного ответа , как они два в электронном виде окислить (псевдо-) галогениды к соответствующему гипо (псевдо) halous кислоты , которые известны своими бактерицидными свойствами 14-16. В физиологических условиях MPO в основном формы хлорноватистой кислоты (HOCl) и hypothiocyanite (- OSCN) в то время как последний и бромноватистая кислоты (HOBr) образованы EPO 17-19. Новые результаты свидетельствуют о том, что это (псевдо-) активность фермента галогенирования может также способствовать регуляции воспалительных реакций и к прекращению иммунных реакций 20,21. На самом деле, производство HOCl МРО и полученных из них продуктов были показаны для подавления клеток на основе адаптивного иммунного ответа Т – 22-24.
Для того чтобы получить более полное представление о иммунологической роли лейкоцитов от врожденной иммунной системы при хронических воспалительных заболеваниях, а также определения вклада MPO и ЕПВ к этой физиологической функции мы разработали метод, позволяющий быстро обогащать лейкоциты из небольших образцов крови для последующего специфического определение активности галогенирующего пероксидазы в этих клетках. Для разрушения эритроцита мы выбрали стандартный метод, включая два последующих гипотонических шагов лизиса с дистиллированной водой, что приводит к быстрому обогащению лейкоцитов при низких материальных затратах. Для последующего определения галогенирующего MPO и активности ЕРО HOCl- и HOBr специфические аминофенил краситель флуоресцеин (APF) использовали 25-27. В отличие от применения методов окрашивания неспецифическое пероксидазы 28,29, этот подход позволяет избирательно обнаружение активности галогенирования пероксидазы, которая часто нарушенную при тяжелой Влиянammation 30,31.
Поскольку нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоциты в крови человека выделение пероксидаза-положительных клеток , фокусирует часто только на этих клетках , и включает в себя отделение нейтрофилы от других лейкоцитах путем центрифугирования в градиенте плотности 38….
The authors have nothing to disclose.
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
materials/equipment | |||
15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |