Novel Выделение РНК-связывающих белков Стремительное Методология
Summary
RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.
Abstract
RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.
Introduction
РНК-связывающие белки (ОДП) составляют около 10% от S. CEREVISIAE белки 1,2 и около 15% белков млекопитающих 3-5. Они участвуют во многих клеточных процессах, таких как мРНК пост-транскрипционной обработки и регулирования, перевод, биогенеза рибосом, тРНК аминоацилирования и модификации, хроматина и многое другое. Важной подгруппой ОДП является мРНК-связывающие белки (mRNPs) 6,7. В процессе созревания мРНК, различные ОДП связывают расшифровку и урегулируют свою ядерную переработку, экспорт из ядра, клеточной локализации, трансляции и деградации 6-8. Таким образом, определенный набор ОДП, связанных с конкретным транскрипта в любой момент времени определяет его обработки и в конечном счете его судьба.
Идентификация ОДП, связанных с мРНК может значительно улучшить наше понимание процессов, лежащих в основе их пост-транскрипционной регуляции. Различные генетические, Микроскопические, биохимические и биоинформатики методы были использованы для идентификации белков , участвующих в регуляции мРНК (обзор 9-11). Тем не менее, лишь немногие из этих методов позволяют идентифицировать белки, связанные с конкретной мРНК-мишени. Следует особо отметить Дрожжи Три Гибридная система (Y3H), которая использует мРНК представляют интерес в качестве приманки для скрининга библиотеку экспрессии в клетках дрожжей. Положительные клоны, как правило , наблюдается через выражение выбора роста или репортера 12-14. Основным преимуществом этого метода является большое количество белков, которые можно сканировать в сотовой среде и способность измерения силы взаимодействия РНК-белок. Недостатками включают относительно большое число ложных положительных результатов из-за неспецифического связывания, а также высокий потенциал ложных отрицательных результатов из-за, в частности, до неправильного сворачивания от добычи слитого белка или РНК приманки.
Альтернативой генетического подхода является сродство purifiКатион РНК с его ассоциированных белков. Поли А-содержащий мРНК, могут быть выделены посредством использования олиго дТ колонн, и их ассоциированные белки обнаруживаются с помощью масс-спектрометрии. Взаимодействие РНК-белок сохраняется в клеточном контексте путем сшивания, что делает малой дальности ковалентные связи. Использование олиго дТ колонке дает общее представление о всей протеома , который связан с любым поли – А-содержащей мРНК 3,5,15. Тем не менее, это не дает список белков, которые связаны с определенной мРНК. Очень немногие из них будут доступны для выполнения такой идентификации. Метод ПАР влечет за собой трансфекцию нуклеиновой кислоты с комплементарности мРНК – мишени 16,17. Нуклеиновая кислота также присоединен к пептиду, который позволяет сшивающего ОДП в непосредственной близости от сайта взаимодействия. После сшивания, КПБ-пептид-нуклеиновая кислота может быть выделена и подвергнута анализу протеомики. В последнее время методология аптамеры на основе былауспешно применяется для извлечения из клеточных линий млекопитающих 18. РНК аптамеров с улучшенным сродством к стрептавидином была разработана и слиты с последовательностью, представляющей интерес (АС богатых элемент (ARE), в данном случае). РНК аптамеров-ARE была присоединена к стрептавидином бус и смешивают с лизата клеток. Белки, которые связаны с последовательности были очищены и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (МС). Хотя этот метод обнаружены ассоциации , которые имеют место вне клеточных параметров (то есть, в пробирке), то, вероятно, будет изменен в будущем , с тем , чтобы ввести аптамеров в геном и , таким образом , позволяют выделение белков , ассоциированных с мРНК , в то время как в клеточная среда (то есть, в естественных условиях). У дрожжей, где генетические манипуляции хорошо установлена, экспрессный метод (разработан в лаборатории профессора Джеффа Джерст в) обеспечивает представление ассоциаций 19 в естественных условиях. RAPID сочетает в себе конкретное и сильное связывание белка MS2 пальто (MS2-CP) в РНК последовательности MS2, и на стрептавидин-связывающий домен (СБП) с стрептавидином гранулами, конъюгированными. Это обеспечивает эффективную очистку MS2-меченых мРНК через стрептавидином бусин. Кроме того, выражение 12 копий петель МС2 позволяет использовать до шести MS2-ХП связываться одновременно с РНК и повышение эффективности ее изоляции. Таким образом, этот протокол был предложен для того, чтобы идентифицировать новые мРНК-ассоциированных белков, как только элюированные образцы подвергали анализу протеомики с помощью масс-спектрометрии.
Недавно мы использовали RAPID для идентификации новых белков , связанных с дрожжами Pmp1 мРНК 20. Pmp1 мРНК ранее показано, что связано с ER мембрану и обнаружили , что его 3 'нетранслируемой области (UTR) , чтобы быть главным фактором , определяющим в этой ассоциации 21. Таким образом, ОДП , которые связывают Pmp1 3 'UTR, вероятно, играют важную роль в его локализации. RAPID с последующей жидкостной хроматографY-масс – спектрометрии / масс – спектрометрии (ЖХ-МС / МС) привело к идентификации многих новых белков , которые взаимодействуют с Pmp1 20. Здесь мы приводим подробный протокол методологии RAPID, важные элементы управления, которые должны быть сделаны, и технические советы, которые могут улучшить урожайность и специфичность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Различные методы используют выделение специфических мРНК для выявления связанных с ними белков 11,34 35. Эти методы применяются в пробирке и в естественных условиях стратегий для исследования РНК-белковых взаимодействий. В пробирке методы инкубировать экзоген…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим профессора Джеффа Джерст и Борис Слободин за их полезные советы по настройке Стремительное протокола и предоставления необходимых плазмид. Мы также благодарим доктора Avigail ATIR-Ланде за помощь в создании этого протокола и д-р Тамар Зива из Smoler протеомики Центра за помощь с анализом LC-MS / MS. Мы благодарим профессора Т.Г. Kinzy (Rutgers) для YEF3 антитела. Эта работа была поддержана грантом 2011013 от научного фонда бинасиональ.
Materials
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1 x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
Referenzen
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3′-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward–one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
