Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS<__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

Protéines liant l'ARN (RBP) représentent environ 10% de S. protéines cerevisiae ^1,2 et environ 15% de protéines de mammifères ^3-5. Ils sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que le traitement de l'ARNm post-transcriptionnelle et de régulation, la traduction, la biogenèse des ribosomes, ARNt aminoacylation et modification, remodelage de la chromatine, et plus encore. Un sous – groupe important de la RBP est les protéines d'ARNm de liaison (mRNP) ^6,7. Au cours de l' ARNm maturation, différentes RBP lient la transcription et la médiation de son traitement nucléaire, l' exportation hors du noyau, la localisation cellulaire, la traduction et la dégradation ^6-8. Ainsi, l'ensemble distinct de pratiques commerciales restrictives liées à une transcription particulière à tout point de temps détermine son traitement et, finalement, son sort.

L'identification des pratiques commerciales restrictives associées à un ARNm pourrait améliorer considérablement notre compréhension des processus qui sous-tendent leur régulation post-transcriptionnelle. Diverse génétique,, Les méthodes bio – informatiques biochimiques et microscopiques ont été utilisées pour identifier des protéines impliquées dans la régulation de l' ARNm (revu dans ^9-11). Cependant, seulement quelques-unes de ces méthodes ne permettent l'identification de protéines associées à un ARNm cible particulier. Il est à noter la levure Trois système hybride (Y3H), qui utilise l'ARNm d'intérêt comme appât pour cribler une banque d'expression dans les cellules de levure. Les clones positifs sont généralement observés à travers une expression de sélection de croissance ou reporter ^12-14. Le principal avantage de cette méthode est le grand nombre de protéines qui peuvent être scannés dans un environnement cellulaire et la capacité de mesurer la force de l'interaction ARN-protéine. Les inconvénients comprennent le nombre relativement élevé de résultats faussement positifs en raison de la liaison non spécifique, et le potentiel élevé de résultats faussement négatifs dus, en partie, à repliement de la proie de protéine de fusion ou l'ARN appât.

Une alternative à l'approche génétique est purifi affinitécation de l'ARN avec ses protéines associées. Poly A contenant des ARNm peut être isolé en utilisant des colonnes d'oligo dT et de leurs protéines associées sont détectées par spectrométrie de masse. L'interaction ARN-protéine est conservée dans son contexte cellulaire par réticulation, ce qui rend à courte portée des liaisons covalentes. L'utilisation de la colonne oligo dT donne une vue globale de l'ensemble du protéome qui est associé à une poly A-ARNm contenant ^3,5,15. Toutefois, cela ne constitue pas une liste des protéines qui sont associées à un ARNm particulier. Très peu de méthodes sont disponibles pour accomplir une telle identification. La méthode PAIRE implique la transfection d'acide nucléique avec la complémentarité à l'ARNm cible ^16,17. L'acide nucléique est également attaché à un peptide, ce qui permet de réticuler RBP à proximité immédiate du site d'interaction. Après réticulation, l'acide RBP-peptide-nucléique peut être isolé et soumis à une analyse protéomique. Récemment, une méthodologie fondée sur aptamère étaitappliquée avec succès à des extraits de lignées cellulaires de mammifères ^18. Un aptamère d'ARN avec une meilleure affinité pour la streptavidine a été développée et fusionnée à une séquence d'intérêt (élément riche en AU (ARE) dans ce cas). L'aptamère-ARE L'ARN a été fixé à des billes de streptavidine et on le mélange avec le lysat cellulaire. Les protéines qui est associée à la séquence sont ont été purifiés et identifiés par spectrométrie de masse (MS). Bien que cette méthode a détecté des associations qui se produisent en dehors des paramètres cellulaires ( par exemple, in vitro), il est susceptible d'être modifiée ultérieurement , de manière à introduire les aptamères dans le génome et permettre ainsi l'isolement des protéines associées à l'ARNm tandis que dans le milieu cellulaire ( par exemple in vivo). Dans la levure, où les manipulations génétiques sont bien établies, la méthode RaPID (développé dans le laboratoire du professeur Jeff Gerst) fournit une vue des associations in vivo ^19. RaPID combine la MS2- spécifique et forte liaison de la protéine d'enveloppe de MS2 (CP) à la séquence d'ARN de MS2 et du domaine de liaison à la streptavidine (SBP) à la streptavidine billes conjuguées. Cela permet une purification efficace des ARNm MS2-marqués par des billes de streptavidine. En outre, l'expression de 12 copies de MS2 boucles permet jusqu'à six MS2-CPs se lier simultanément à l'ARN et d'accroître l'efficacité de son isolement. Ce protocole a donc été proposé pour permettre l'identification de nouvelles protéines d'ARNm associé à la fois les échantillons éluées sont soumises à une analyse protéomique par spectrométrie de masse.

Nous avons récemment utilisé RaPID pour identifier de nouvelles protéines associées à la levure PMP1 ARNm ^20. PMP1 ARNm a été montré précédemment à être associée à la membrane du RE et de sa région 3 'non traduite (UTR) a été trouvé pour être un déterminant majeur dans cette association ^21. Ainsi, les pratiques commerciales restrictives qui lient PMP1 3 'UTR sont susceptibles de jouer un rôle important dans sa localisation. Rapide suivie chromatographe liquidey-spectrométrie de masse / spectrométrie de masse (LC-MS / MS) a abouti à l'identification de nombreuses nouvelles protéines qui interagissent avec PMP1 ^20. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de la méthodologie RaPID, des contrôles importants qui doivent être faites, et des conseils techniques qui peuvent améliorer le rendement et la spécificité.