JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemie

Одиночных молекул Super-Resolution Imaging фосфатидилинозит 4,5-бисфосфат в плазматической мембране с новыми флуоресцентных зондов

Published: October 15, 2016
doi:
10.3791/54466
,
1Department of Neuroscience,University of Wisconsin-Madison

Summary

PI (4,5) P 2 регулирует различные клеточные функции, но его наноразмерных организация в клеточной мембране плазмы мало изучен. Навешивая PI (4,5) P 2 с двухцветными флуоресцентным зондом , слитого с доменом Pleckstrin гомологий, мы опишем новый подход для изучения PI (4,5) P 2 пространственное распределение в мембране плазмы в нанометровом масштабе ,

Abstract

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

Introduction

Фосфоинозитиды внести свой вклад в небольшой части общего количества мембранных липидов, но играют важную роль в различных клеточных процессов. Они включают в себя семь членов , полученных из обратимого фосфорилирования или дефосфорилирования инозитольного колец на 3 – й, 4 – й и 5 – й позиции 1. Фосфатидилинозитол 4-фосфат (PI4P) и фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PI (4,5) P 2) являются двумя основными фосфоинозитиды , которые функционируют независимо друг от друга относительно как детерминант липидов клеточной мембраны плазмы (ПМ) 2,3. Фосфатидилинозитол (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) гораздо менее многочисленны , чем PI4P и PI (4,5) P 2, но она имеет уникальные функции в различных клеточных процессах , включая рак и диабет 4 5. Эти липиды имеют сложные молекулярные взаимодействия с их эффекторами и многих других белков. Поэтому крайне важно, чтобы понять пространственную организацию этих фоsphoinositides в ПМ в нанометровом масштабе.

Монтажные данные показали , что белковые комплексы или кластеры молекулы в условиях ограниченного пространства ТЧ могут служить в качестве сигнальных точек доступа 6. Например, синтаксин 1a, ключевой белок , который регулирует слияние мембран 7-9, отображает организацию кластеров в ПМ. В отличие от представления консенсус кластера организации синтаксин 1а, пространственное распределение фосфоинозитидов в ПМ является спорным. Структуры распределения PI (4,5) P 2 в диапазоне от равномерного 10-12, крупные пятна 13,14, плотных кластеров 14-18, в зависимости от типов клеток и экспериментальных методов , используемых. Пространственная организация PI (4,5) P 2 с более высоким разрешением также противоречивы. Исследование , проведенное с использованием стимулированного излучения истощения (STED) микроскопии 19 показал большое количество плотной PI (4,5) P 2 нанокластеров (~ 73 нм в диаметре) в ПМ листов РС-12 ячеек 20 </sвверх>. Этот результат отличается от исследований с использованием быстрого замораживания электронной микроскопии (ЭМ) 21,22, подход , который сохраняет цельную структуру ПМ живых клеток намного лучше , чем химической фиксации. Последние показали отличные бассейны PI (4,5) P 2; относительно концентрированным PI (4,5) P 2 в кавеол и покрытых ямок, а также равномерное распределение на плоской ПМ области. Кроме того, наноразмерные PI (4,5) P 2 организация в мембранных листов могут отличаться в живых и фиксированных клеток. Наша недавняя работа исследовал этот вопрос как стационарных , так и живых клеток INS-1 с использованием одной молекулы локализации микроскопии (SMLM) 23.

SMLM основан на стохастически включении только небольшое подмножество флуорофоров в любой момент времени, так что отдельные флуорофоры могут быть локализованы с высокой точностью. Многие подходы формирования изображения сверхвысокого разрешения были разработаны с использованием аналогичных принципов, чтобы превзойти дифракционный предел обычной световой микроскопии, такойs фотоактивация локализации микроскопии (PALM) 24, флуоресценция локализация фотоактивация микроскопии (FPALM) 25, стохастические оптической микроскопии реконструкции (STORM) 26,27 и прямой STORM (dSTORM) 28. С фото-переключаемые или фотоактивируемых флуорофоров (красители или флуоресцентные белки), методы SMLM позволяют ученым изображения биологических структур на нанометровым разрешением 24,29,30 с видео-скоростью в живых клетках 31,32.

Использование PI (4,5) P 2 в качестве примера, мы ввели SMLM подход к изучению распределения наноразмерных фосфоинозитидов на ПМ. Домен РН PLCδ1 (фосфолипазы C б1) , который специфически связывается с PI (4,5) P 2 представляет собой хорошо установленный зонд для визуализации PI (4,5) P 2 субклеточном распределения и динамики 33,34 в ПМ , Мы генетически помечены этот домен с двумя флуоресцентными белками, PAmCherry1 35 и iRFP 36 </SUP> для получения двойного цвета слитый белок (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (рис 1A-B). PAmCherry1 служит Фотоактивируемые зондом домена PH для PALM и iRFP служит общим индикатором для выявления трансфицированных клеток до приобретения PALM , Мы применяем этот двухцветными флуоресцентный зонд для SMLM визуализации в фиксированных мембранных листов. Для PALM изображений живых, мы помечены mEOS3 37 вместо PAmCherry1 к домену PH PLCδ1 для генерации mEOS3.1-PH PLCδ1 зонд для его лучшей эффективности фотонного и яркости (рис 1C-D).

SMLM изображений с этими новыми зондами в ПМ INS-1 клеток , 38 секретирующих инсулин раскрыло гомогенную мечение PI (4,5) P 2 в большинстве регионов РМ, а также концентрированное PI (4,5) P 2 микродомены, которые слабо перемешаны в квартире PM и некоторых филоподий-подобных структур 23. Затемnoscale распределение PI (4,5) P 2 обеспечивает структурную основу для переосмысления , как он функционирует в живых клетках.

Protocol

1. Мембрана лист Подготовка и фиксация Подготовьте листы мембраны , меченные iRFP-PAmCherry1-PH PLC б1 Подготовка плазмидной ДНК , кодирующий iRFP-PAmCherry1-PH PLC б1 23 с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Культура INS-1 клетки на # 1,5 18 мм круглые покровные предварительно покрытые 30 мкг / мл фибронектина на 50-70% сплошности в соответствии со стандартными INS-1 протоколов культивирования клеток 38,39. Трансфекции клеток день после того, как от 50 до 70% конфлуэнтности достигается. Трансфекцию клетки с iRFP-PAmCherry1-PH PLC б1 с использованием реагента для трансфекции липосом следуя протоколам производителя. После трансфекции, позволяют клеткам расти в течение 48 часов. В день эксперимента, пальто покровные (на одной стороне) , с ~ 0,5 – 1 мл 500 мкг / мл поли-D-лизин (PDL; разводили в дН 2 O) в течение 1-2 ч. Затем слейте PDL путем размещения папиросной бумаги накрай покровного стекла. Поместите покровные на предварительно охлажденной (4 ° C) металлической пластины для последующего использования. Промыть предварительно трансфицированных клеток СИН-1, растущие на покровных стеклах с ~ 0,5 – 1 мл охлажденного льдом фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), содержащем 1 мМ EGTA. Повторите для стирки три раза и слейте PBS. Поместите покровные с культивированных клеток (клеток-лицевой стороной вниз) на покровные PDL покрытием на предварительно охлажденный металлическая пластина с парой пинцетов. Оставьте пластину в холодильнике (4 ° C) в течение 7 – 10 мин , чтобы позволить клеткам прикрепляться к покровные PDL покрытием (рисунок 2). Примечание: Время инкубации должно быть в диапазоне от 7 – 10 мин, для лучшего прикрепления клеток к поверхности PDL покрытием. Среда холодильник сухая и инкубации, не должно быть слишком длинным. Удалите металлическую пластину из холодильника. Аккуратно отделите покровное, содержащий предварительно трансфецированных клеток с помощью пинцета. Это создает тонкий слой клеточной мембраны листа наPDL покрытием покровное. Осторожно промыть мембранные листы с ~ 0,5 – 1 мл охлажденного на льду PBS и затем зафиксировать с ~ 0,5 – 1 мл охлажденного на льду 4% параформальдегида (PFA) + 0,2% глутарового альдегида (ГА) в PBS в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Внимание: параформальдегид и глутаровый альдегид являются токсичными. Обращайтесь с ними в вытяжном шкафу с кожей и средства защиты глаз. После фиксации изображения мембраны листов сразу (смотри раздел 3) или хранить в ~ 0,5 – 1 мл PBS при 4 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации мембраны листа, не будет никакого равновесия связывания PH зондов из цитозоля PI (4,5) P 2. Связанные PH зонды будут постепенно отделяться от мембранного листа и диффундируют в раствор (хотя это может занять несколько дней до нескольких недель). Поэтому, рекомендуется к изображению фиксированные образцы сразу после приготовления образца. Подготовьте листы мембраны для PI (4,5) P 2 специфических антител маркировки Культура INS-1 клетки на # 1,5, 18 мм круглые покровные предварительно покрытые 30 &# 181; г / мл фибронектина до 50% -70% Стечение. Трансфекции клеток с плазмидной ДНК на следующий день, как описано в шаге 1.1.3. Повторите шаги от 1.1.4 до 1.1.7, как описано выше. Примечание: Выполните следующие процедуры при температуре 4 ° С. Вымойте покровные содержащие фиксированные PM листы три раза ~ 0,5 – 1 мл охлажденного льдом PBS , содержащем 50 мМ NH 4 Cl. Quench листы с ~ 0,5 – 1 мл 0,1% борогидрида натрия в PBS в течение 7 мин и промывают ~ 0,5 – 1 мл PBS (без 50 мМ NH 4 Cl). Блок образцов с ~ 0,5 – 1 мл блокирующего раствора (PBS раствор , содержащий 5% (об / об) нормальной козьей сыворотки, 5% (об / об) бычьего сывороточного альбумина и 50 мМ NH 4 Cl) в течение 45 мин. Затем, инкубировать с ~ 0,5 – 1 мл первичного PI (4,5) P 2 антитела (1: 300 разбавление) в блокирующем растворе в течение 1 часа. Промыть три раза (10 мин каждый раз) с ~ 0,5 – 1 мл PBS , содержащем 50 мМ NH 4 Cl. Инкубируйте образцы с ~ 0,5 – 1 мл вторичного F (аb ') 2-козьей-анти-мышьантитела, конъюгированного с флуорофоров (1: 300) в блокирующем буфере в течение 1 часа. Промыть три раза с ~ 0,5 – 1 мл PBS. Образцы после починкой с 4% PFA + 0,2% GA в течение 15 мин, затем промыть образцы трижды PBS (7 мин каждый раз). Переходите к разделу 3 для работы с изображениями или хранить в ~ 0,5 ~ 1 мл PBS при 4 ° С для последующего использования. Примечание: подготовить образцы при температуре 4 ° С. Используйте 4% PFA + 0,2% GA закрепитель для сохранения физиологического распределения фосфоинозитидов в ПМ. Подготовка RT или фиксация только 4% PFA может вызвать значительные артефакты (Рисунок 4). 2. Подготовка клеточной культуры для живых клеток изображений с mEOS3.1-PH PLC б1 Готовят плазмидной ДНК , кодирующей & Dgr ; 1 mEOS3.1-PH PLC , как описано выше 23. Культура INS 1-клетки на # 1,5 18 мм круглые покровные предварительно покрытые 30 мкг / мл фибронектина, пока они не достигают 50% -70% confluency в соответствии со стандартными INS-1 протоколов культивирования клеток 38,39. На следующий день трансфекции клеток INS-1 с mEOS3.1-PH PLC δ1 плазмидной ДНК с использованием реагента для трансфекции липосом в соответствии с протоколом изготовления. Инкубируют в течение 48 ч до обработки изображений. 3. PALM Получение изображения мембранных листов и живых клетках PALM получения изображения мембранных листов Примечание: Здесь, полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) система SMLM на базе микроскопа (100X масло, APO, NA = 1,49, WD 0,12 мм) 23 используется для всех получения изображений. Перед изображениями, развести 1 мкл раствора флуоресцентного шарик в 10 мл PBS + 50 мМ MgCl 2. Добавьте 200 мкл разведенного раствора в камеру, содержащую изображения клеточных образцов (с шагом 1.1.8 / 1.2.6) в течение 10 мин. Затем промывают PBS трижды. Запустите систему PALM изображения. В соответствующее программное обеспечение обработки изображений, выберите "канал iRFP &# 34; Кнопка (642 нм лазерного возбуждения, 700/75 нм излучение). Найти клеточную мембрану, выражающую PH зондов в канале iRFP. Примечание: Мембрана лист должен иметь флуоресцентный шарик рядом. Это необходимо для коррекции дрейфа позже. Используйте кнопку "Capture", чтобы собрать обычный TIRF изображение клеточной мембраны в канале iRFP в качестве эталона для будущей реконструкции изображения. Установить нормальный угол TIRF (то есть, после достижения критического угла, повернуть еще 1,5 градусов), введя в 2140 в настройке для работы с изображениями угла TIRF. Используйте этот угол установки для всех шагов, если не указано иное. Примечание: В системе TIRF описанной здесь, 3500 является вертикальным углом вверх, 2,200 критический угол TIRF, и 2140 является нормальным углом TIRF, что на 1,5 градусов больше после TIRF критического угла. Узкий угол TIRF, упомянутый ниже в пункте 3.2.3 является 2120, что является еще 2 степени после достижения TIRF критического угла. Переключиться на канал PAmCherry1, нажав юКнопка RFP канала е (561 нм возбуждение, 600/50 нм эмиссионного фильтра). Отрегулируйте полосу прокрутки в "AOTF" площадку весь путь вправо, чтобы иметь полную мощность освещения 561 нм лазера на 10-20 сек, чтобы отбелить фон мембранной флуоресценции. Установить оптимальные настройки камеры (2х2 биннинга) на вкладке «Формат» и быстрый протокол сбора на вкладке "Сбор последовательность ND" (обычно 10,000-40,000 изображения при 20 Гц). Начало приобретение PAmCherry1 изображений (561 нм лазер на полной мощности, 50 мс / кадр) с одновременным 405 нм лазерной активации на низком уровне (0,1% – 1%), нажав на кнопку "Запуск". Отрегулируйте интенсивность 405 нм лазера таким образом, что пространственно отдельные изолированные точки в каждом кадре легко идентифицировать. Примечание: Количество активируемых молекул PAmCherry1 постепенно уменьшается в процессе приобретения. 405 нм интенсивность лазерного излучения должна быть постепенно увеличена, чтобы поддерживать оптимальную плотность индивидуальных сигналов молекул в каждомРамка. Продолжить получение изображений, пока нет сигнала PAmCherry1 одна молекула не будет активирована. PALM изображений в живых клетках До обработки изображений, разбавленные флуоресцентные шарики в камеру формирования изображения в течение 10 мин, как описано в шаге 3.1.1. Затем начните визуализацию PALM, открыв соответствующее программное обеспечение визуализации. Примечание: Используйте магнитную камеру формирования изображения быстрого высвобождения для живых клеток. Поддерживать центр поля изображения при 35 ° C с регулятором температуры при постоянной перфузии с внеклеточной буфером (внеклеточный раствор: 135 мМ NaCl, 5,6 мМ КСl, 2,6 мМ CaCl 2, 1,2 мМ MgCl 2, 3 мМ глюкозы, и 20 мМ HEPES, рН = 7,3). Нажмите кнопку GFP канала (525/50 нм излучения). Определить клеточную мембрану, выражающую флуоресцентных зондов на основе зеленого флуоресцентного из mEOS3 при длине волны 488 нм лазерного возбуждения. Убедитесь, что флуоресцентные шарики поблизости также включены во время съемки, так как это требуется позже для автономного сушкоКоррекция футов. Нажмите на кнопку "Capture", чтобы собрать TIRF изображение клеточной мембраны в канале mEOS3 (зеленый) в качестве опорного изображения. Используйте неглубокую мимолетную освещение волны возбуждения (после достижения критического угла, повернуть еще на 2 градуса), введя в 2120 в TIRF угол установки для получения изображений живых клеток. ПРИМЕЧАНИЕ: Это минимизирует флуоресценции от несвязанного mEos3-PH в цитозоле прилегающей к плазматической мембране. Переключитесь на "RFP канала" кнопка (561 нм возбуждение, 600/50 нм излучение). Используйте полную мощность 561 нм лазер отбеливать фоновой флуоресценции мембранных листов в течение 10 ~ 20 сек с скроллинга в "AOTF колодки" (см 3.1.4). Начало получения изображения, нажав на кнопку "Запуск" в красном канале (561 нм полную мощность, установленный на 10 мс / кадр в "камере" настройки вкладки) с одновременным 405 нм лазерной активации. Регулировка интенсивности лазерного излучения на 405 нм, чтобы активировать пространственно разнесенных точкахв каждом кадре. Примечание: По ходу приобретения, ип-конвертированы mEOS3.1-PH PLC δ1 номер молекулы медленно уменьшается. Постепенно увеличивают мощность лазера 405 нм, чтобы оптимизировать один сигнал молекулы. Длина сбора изображений зависит от экспериментальных целей. Получение изображений непрерывно в течение 5 мин при нормальных условиях. Если требуется больше приобретение, собрать несколько стеков изображений вместо одной большой стек изображений. Размер файла каждого стека изображения не должна превышать 4 ГБ или это повлияет на программное обеспечение для анализа позже. 4. SMLM Обработка изображений и реконструкция Передача файлов изображений (.tif изображений стеки) к анализу изображений станции. Запустите программу восстановления изображений ( на заказ) в письменном виде Matlab , как описано выше 37 и загрузите стопку изображения, нажав на вкладку "Файл" в главном меню, а затем "открыть", а затем "новый файл". Определить и локаатрических отдельные молекулярные события из каждого кадра. Установка фильтрации порог интенсивности с пороговым числом (1-10) в "вейвлете". Проверьте оптимальные настройки параметров для обнаружения точки зрения до реконструкции. Затем перейдите на вкладку "PALM" и нажмите кнопку "один процесс шаг", чтобы приступить к реконструкции изображения. Примечание: Интенсивность Порог для обнаружения точки произвольно и зависит от личного опыта. Несколько испытаний может потребоваться для создания оптимального порога обнаружения в том, что ни один не поднимает слишком много неквалифицированных (DIM) точек и не отфильтровывает слишком много квалифицированных (светлый) баллов. Настройка других параметров для оптимизации анализа данных. Здесь окрестность расстояние (флуоресценция точек в соседних кадрах в пределах расстояния комбинируются) устанавливается как 65 нм (1/2 ширины пикселя) и установлены в качестве одной молекулы. Щелевые кадры (отдельные события молекулы, которые имели место в пределах этих фреймов и окрестности расстояния были объединены и установлены в качестве одного события молекулы) являетсяустанавливается как 26 кадров (1,3 сек) для обработки изображений PAmCherry1 40. Настройка этих параметров в соответствии со свойствами отдельных зондов молекулы и скорость сбора данных , чтобы избежать чрезмерного подсчета 40 в SMLM. Применить коррекцию дрейфа с помощью флуоресцентных шариков во время реконструкций. Для визуализации неподвижных мембранных листов , помеченных iRFP-PAmCherry1-PH PLC б1, реконструировать целые стеки изображения из той же мембраны листа в один супер-разрешением изображения 37. Для получения образцов живых клеток , помеченных mEOS3.1-PH PLC б1, отделить весь стек изображения на несколько более мелких штабеля 1000 кадров таким образом , чтобы стек 1000 последовательных кадра восстанавливается как единый супер-разрешением изображения, которая имеет временное разрешение 10 сек. В конце концов, объединить все изображения , временные ряды в стек 23 серии последний раз. Примечание: В визуализации PALM живых клеток, небольшое количество активированных зондов может двигаться или диссоциироватьот PI (4,5) P 2 в ПМ перед отбеливанием. Для учета оверсемплингом зондов, объединять отдельные сигналы молекулы в соседних кадрах в пределах 130 нм (вместо 65 нм) в одном случае выбросов в ходе анализа изображений. После получения реконструированные изображения, проводить дальнейший анализ изображения с помощью специально написанная программа в Matlab для количественной оценки плотности молекул, плотность микро-домен / размер и кластерного анализа с парной корреляции 41.

Representative Results

Неопределенность локализации (σ) нашей системы супер-разрешение составляет 14,73 нм 23. Прямые сравнения между TIRF и пальмовое изображений продемонстрировали значительное улучшение пространственного разрешения. Рисунок 3A-B показывает , представитель PI (4,5) P 2 TIRF изображений , меченные PI (4,5) P 2 антитела и iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 в типичных мембранных листов и живых клеток. Изображения с традиционной TIRF микроскопии в мембранных листов удивительно похожи на те , в неповрежденных живых клеток , меченных с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) помечено PH домены (EGFP-PH PLCδ1) (рис 3C). Все образцы показали равномерное распределение зондов. В противоположность этому , неоптимальное фиксация образцов привело к резкому плотной PI (4,5) P 2 кластеров и уменьшение интенсивности сигнала (рис 4). При оптимальных условиях фиксации, тон изображения супер-разрешением PI (4,5) P 2 в фиксированных клеток (рисунок 5) показал равномерное распределение зондов в значительной части ПМ только с ограниченным градиентов концентрации. Некоторые мембранные участки , обогащенные PI (4,5) P 2 зондов были распределены редко и имели различные размеры. Живая клетка PALM изображения отображаются аналогичное пространственное распределение в виде неподвижных клеток (рисунок 6). Детальный анализ PI (4,5) P 2 сигналов по времени приводит к быстрой динамики в локальных областях, без существенных изменений их численности в широких областях. Рисунок 1. Схема для флуоресцентных зондов , используемых в данном исследовании. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC б1 зонд , используемый в экспериментах с фиксированной мембраной листа. Во время обычного TIRF визуализации (А), 640 нм лазер используется для возбуждения iRFP (Ex: 692 нм; Em: 713 нм). TIRF изображение , полученное в этом состоянии служит в качестве эталонного изображения TIRF для сверхвысокого разрешения изображений , полученных с помощью PALM томографии (B). 405 нм лазер используется для фото-активации флуорофор PAmCherry1 и 561 нм лазер используется для возбуждения PAmCherry1 (Ex: 564 нм, Em: 595 нм) для работы с изображениями PALM. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 зонд , используемый в экспериментах живых клеток. (C) Во время обычного TIRF визуализации, 488 нм лазер используется для возбуждения mEOS3.1 (Ex: 506 нм, Em: 519 нм). (D) После фотоконверсии по 405 нм лазером, mEos3.1 превращается в красной форме (Ex: 573 нм, Em: 584 нм). И 561 нм лазер используется для приобретения PALM Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию эта фигура. s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg "/> Рисунок 2. Схема мембранного препарата листа из клеток СИН-1. (А) Поместите покровное с культивируемыми клетками , стоящих вниз на покровное ФДЛ покрытием и ждать , 7 ~ 10 мин при 4 ° С , чтобы позволить прикрепление клеток к PDL- покровное покрытие. (B) снимите верхний покровное с помощью пинцета и закрепите мембранный лист , прикрепленный к предварительно покрытой покровным PDL. (C) Изображение образцов с TIRFM и пальмовое. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. PI (4,5) P 2 пространственная организация похожа между мембранными листами и неповрежденных живых клеток под обычным микроскопом TIRF. (A)Типичная TIRF изображение мембранных листов фиксируется при 4 ° С с 4% PFA и 0,2% GA. PI (4,5) P 2 метили PI (4,5) P 2 специфические антитела. (B) Мембрана лист из INS-1 клетки , экспрессирующие iRFP-PAmCherry1-PH PLC б1. (С) TIRF изображение двух интактных живых клеток , экспрессирующих EGFP-PH PLCδ1 на разных уровнях. Шкала баров: (A): 3 мкм; (B) и (C):. 5 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4. PI (4,5) P 2 пространственная организация в мембранных листов чувствителен к общим условий фиксации. (А) очистки мембранным листов фиксируется при 37 ° С с 4% PFA в одиночкуи метили PI (4,5) P 2 специфическими антителами (как показано на Рисунке 3А). (B) Мембранный лист фиксируется при КТ только PFA и метили PI (4,5) P 2 специфические антитела. Следует отметить , что плотные скопления PI (4,5) P 2 зонда хорошо видны под микроскопом TIRF, в отличие от гораздо более даже флуоресцентных изображений , показанных на рисунке 3А. Шкала баров: AB:. 3 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5. PALM визуализация PI (4,5) P 2 зондов показывает их распределение в нанометровом масштабе в ИНС-1 клеток PM. (A) iRFP TIRF изображение мембранного листа из INS-1 клетки , экспрессирующие iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (В) Соответствующая PALM образ ПМ в том же регионе на основе реконструкции PAmCherry1 сигнала. Обратите внимание на однородное PI (4,5) P 2 пространственное распределение в основных регионах PM и несколько PI (4,5) P 2 микродомены. (С) Увеличенный вид в штучной упаковке области в (B). Стрелки указывают единично PM микродоменов , обогащенные PI (4,5) P 2 датчика. Масштабные бары: А и Б: 3 мкм; C: 500 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 6. PALM визуализации в клетках живых INS-1. (А) TIRF образ PI (4,5) P 2 в прямом эфире INS-1 клеток , экспрессирующих mEos3.1-PH PLCδ1. Изображение быстро приобрела в зеленом канале до приобретения PALM (35 ° C). (B) Последовательные живых клеток PALM изображения на 10 секундным интервалом. Вставках показаны профили интенсивности локального PI (4,5) P 2 плотности вдоль той же прямой линии 1 позицию в разное время в (В) и (С). Обратите внимание, их большие локальные изменения интенсивности в течение 10 сек. (D) Временной ход средних изменений интенсивности PI (4,5) P 2 в большой площади (BOX2, 3х3 мкм) и малых кругов (3, 4, и 5, диаметр 500 нм) в (B) в течение 5 мин изображения PALM (кадр / 10 сек). Обратите внимание на резкие колебания интенсивности локальных PI (4,5) P 2 зонда (круг 3, 4 и 5) по сравнению с очень небольшими изменениями в широкой области (вставка 2). (Е) Увеличенная PALM изображения региона BOX2 в (B) в указанное время. Стрелки указывают PI (4,5) P 2 , обогащенные мембранные участки под рhysiological условия. Шкала баров: C: 3 мкм; E: 500 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Для устранения неполадок, два процесса требуют особого внимания: мембранное производство листа и образца фиксации. Как описано в протоколе, время инкубации покровные на этапе 1.1.6 имеет важное значение для производства мембранного листа. Оптимальное время инкубации при нашем экспериментальном состоянии составляет 7-10 мин (рисунок 2). Более чем 10-минутной инкубации будет производить неповрежденные клетки вместо мембранных листов на PDL покровные и более короткой инкубации приведет к менее или без каких-либо мембранных листов на покровные PDL покрытием. Как описано в протоколе, то фиксаторов и температуры во время фиксации имеют решающее значение для поддержания PI (4,5) распределение P 2 в ПМ. Фиксирование при комнатной температуре или использование только 4% -PFA может исказить нормальное распределение липидов в ПМ.

Применяя PALM микроскопии для исследования мембранных липидов, мы можем наблюдать распределение нанометрового масштаба по PI (4,5) P 2, ключ фосфоинозитидного , который посредничает млюбые фундаментальные клеточные активности. Такое пространственное распределение PI (4,5) P 2 с ограниченными градиентов концентрации в клетках INS-1 обеспечивает основу для переосмысления липидный-белковых взаимодействий и локальных сигнальных событий PI (4,5) P 2 в этих клетках. Кроме того, методы, разработанные в данной работе также могут быть применены к другим исследования мембранного фосфолипида с соответствующими зондами, таким образом, предлагая новые инструменты для изучения фосфоинозитиды в биологических процессах.

Применение мембранных листов в этой работе обходит две основные проблемы в фосфолипидных морфологических исследований: Лечение моющее средство и потенциального загрязнения сигнала от цитоплазмы. Моющие средства часто вызывают кластеризацию и значительные потери сигнала фосфолипидов PM. Загрязнение цитозольного сигнала проблема особенно остро стоит в случае низких фосфоинозитидов изобилии на ПМ 23, таких как PI (3,4,5) P 3 и PI (3,4) P 2. Образцы мембран листа способны свободной циркуляцииmvent эти проблемы без существенного нарушения структуры , связанные с плазматической мембраной, такие как корковой актина сетчатая и клатриновых ямах 42,43. Относительное гомогенное распределение PI (4,5) P 2 в ПМ находится в хорошем согласии с другими быстрых исследований замораживания EM с использованием GST-PH PLC б1 зондов в фибробласты мембране 44.

Важно отметить, что неправильные условия обработки образца могут генерировать ошибочные результаты. Во-первых, это имеет решающее значение для выполнения этапов фиксации при более низкой температуре (4 ° C) и использовать закрепляющего GA для производства мембранного листа. Как показано на рисунке 3, теплая температура и PFA фиксации без ГА не является достаточным , чтобы исправить фосфоинозитиды в ячейки PM. Это может исказить неповрежденную PI (4,5) P 2 распределения и генерировать острые кластеры, которые не наблюдаются в живых клетках при физиологических условиях. Во-вторых, использование в качестве PAmCherry1SMLM зонд, а не других зондов, имеет ключевое значение для количественного PALM визуализации. Преимущество применения PAmCherry1 исходит от его хорошо охарактеризованных отдельных молекулярных фото-физические свойства 35,40,45, такие как яркость, высокая эффективность фотоактивация и больше всего, очень ограничено фото-мигания. Эти свойства позволяют устранить потенциальные кассетные артефакты из фото-мигающим и количественного анализа молекулярной плотности мембранного PI (4,5) P 2.

Этот подход также имеет свои ограничения. Во- первых, способ мембранного лист , используемый в этом исследовании , не может полностью имитировать физиологическое распределение PI (4,5) P 2 , потому что ячейка будет прервана до визуализации. Тем не менее, наша живая PALM визуализация показывает аналогичную относительно однородное распределение PI (4,5) P 2, поддерживая результаты с образцами мембраны листа. Во- вторых, как мы уже говорили в предыдущей работе 23, SMLM требует опыта обработки изображений и дополнительной намание, чтобы избежать артефактов визуализации, которые могут возникнуть в результате различных процессов, в том числе используемых зондов, подготовки образцов и фиксации, выборки изображений и реконструкции. И, наконец, хотя зонды и антитела , основанные домен , указанный ИД широко используются в исследованиях фосфоинозитидного 46,47 остается возможным , что не все PI (4,5) P 2 в мембране могут быть обнаружены с помощью этого подхода. Например, PI (4,5) P 2 связанными другими эндогенными белками , не могут быть доступны для PH зондов или антител, и это может привести к недооценке PI (4,5) P 2 из – за пространственной воспрепятствования зондировать себя. Альтернативный способ маркировки PI (4,5) P 2 будет использовать Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, предварительно меченных PI (4,5) P 2 аналог с модификацией на хвосте оригинала PI (4,5) P 2. Тем не менее, она может быть быстро превращается в другие подтипы фосфоинозитидного быстрым клеточного метаболизма живых, так как его инозит кольцо такое же, как endogenous PI (4,5) P 2. В этой связи возникает озабоченность ли эта предварительно меченных PI (4,5) P 2 аналоговых в живых клетках может точно представлять PI (4,5) P 2 , а не его продукты метаболизма. Поэтому, несмотря на некоторые ограничения, зонды на основе домена PH по – прежнему один из лучших зондов, которые широко используются для мониторинга распределения PI (4,5) P 2 и динамику на ПМ клеток.

Будущее применение этой методологии может быть распространена и на другие исследования фосфоинозитидного, таких как PI (3,4,5) P 3 и PI (3,4) P 2. Таким образом, новый SMLM подход, используемый здесь, открывает новые пути для изучения фосфоинозитидного в клетках. Использование PI (4,5) P 2 в качестве примера, мы покажем уникальные свойства изображения PALM в морфологической и количественного исследования клеточных мембран молекул, а также свои недостатки. Такой подход может быть адаптирован к другим молекулам интересов и будет иметь широкое применение в клеточной биологии.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

Materials

Microscope Nikon Ti-U
sCMOS camera Andor Neo
Spinning disk Yokogawa CSU X-1, 10,000 rpm 
 High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. Agilent MLC400 laser original powers & powers at the end of optical fiber)
405nm: 15 mW & 13 mW;
488nm: 45 mW & 42 mW;
561nm: 45 mW & 40 mW;
640nm: 35 mW & 16 mW.
100X Objective Nikon APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm 
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) Nikon
Matlab MathWorks
Coverslip Warner 64-0714 Round 18mm coverslip, #1.5 
Fibronectin Millipore FC010-5MG
Lipofectamin 3000(transfection reagent) Invitrogen L3000-008
Glutaraldehyde Electron Microscopy Science #16120
PI(4,5)P2 1st antibody Santa Cruz sc-53412
secondary antibody  F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21237
Tetraspeck beads Invitrogen T7279
magnetic quick release imaging chamber  Warner Instruments Cat#641994
temperature controller Warner Instruments TC-344C
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Phosphate buffer saline Sigma P4417-100TAB
EGTA Sigma 3780
NH4Cl Sigma A0171
Goat serum Sigma G9023
bovine serum albumin Sigma A7906
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
CaCl2*2H2O Sigma 223506
MgCl2*6H2O Sigma M9272
Glucose Sigma G7021
HEPES Sigma H4034
Paraformaldyhyde Sigma P6148
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, 651-657 (2006).
  2. Hammond, G. R. V., et al. PI4P And PI(4,5)P(2) Are Essential But Independent Lipid Determinants Of Membrane Identity. Science. 337, 727-730 (2012).
  3. Nakatsu, F., et al. PtdIns4P synthesis by PI4KIIIalpha at the plasma membrane and its impact on plasma membrane identity. J Cell Biol. 199, 1003-1016 (2012).
  4. Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science. 296, 1655-1657 (2002).
  5. Czech, M. P. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol. 65, 791-815 (2003).
  6. Spira, F., et al. Patchwork organization of the yeast plasma membrane into numerous coexisting domains. Nat Cell Biol. 14, 640-648 (2012).
  7. Barg, S., Knowles, M. K., Chen, X., Midorikawa, M., Almers, W. Syntaxin clusters assemble reversibly at sites of secretory granules in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20804-20809 (2010).
  8. Sieber, J. J., et al. Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science. 317, 1072-1076 (2007).
  9. Knowles, M. K., et al. Single secretory granules of live cells recruit syntaxin-1 and synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) in large copy numbers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20810-20815 (2010).
  10. Milosevic, I., et al. Plasmalemmal phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate level regulates the releasable vesicle pool size in chromaffin cells. J Neurosci. 25, 2557-2565 (2005).
  11. van Rheenen, J., Jalink, K. Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale. Mol Biol Cell. 13 (2), 3257-3267 (2002).
  12. Hammond, G., Schiavo, G., Irvine, R. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinct cellular pools of PtdIns4P and PtdIns (4, 5) P2. Biochem J. 422, 23-35 (2009).
  13. Huang, S., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-rich plasma membrane patches organize active zones of endocytosis and ruffling in cultured adipocytes. Mol Cell Biol. 24, 9102-9123 (2004).
  14. James, D. J., Khodthong, C., Kowalchyk, J. A., Martin, T. F. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates SNARE-dependent membrane fusion. J Cell Biol. 182, 355-366 (2008).
  15. Laux, T., et al. GAP43, MARCKS, CAP23 modulate PI(4,5)P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 149, 1455-1472 (2000).
  16. Aoyagi, K., et al. The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdomains at syntaxin clusters. J Biol Chem. 280, 17346-17352 (2005).
  17. Kabachinski, G., Yamaga, M., Kielar-Grevstad, D. M., Bruinsma, S., Martin, T. F. CAPS and Munc13 utilize distinct PIP2-linked mechanisms to promote vesicle exocytosis. Mol Biol Cell. 25, 508-521 (2014).
  18. Wang, J., Richards, D. A. Segregation of PIP2 and PIP3 into distinct nanoscale regions within the plasma membrane. Biol Open. 1, 857-862 (2012).
  19. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
  20. van den Bogaart, G., et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions. Nature. 479, 552-555 (2011).
  21. van Rheenen, J., Achame, E. M., Janssen, H., Calafat, J., Jalink, K. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. Embo J. 24, 1664-1673 (2005).
  22. Sato, K., et al. Differential requirements for clathrin in receptor-mediated endocytosis and maintenance of synaptic vesicle pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1139-1144 (2009).
  23. Ji, C., Zhang, Y., Xu, P., Xu, T., Lou, X. Nanoscale Landscape of Phosphoinositides Revealed by Specific Pleckstrin Homology (PH) Domains Using Single-molecule Superresolution Imaging in the Plasma Membrane. J of Biol Chem. 290, 26978-26993 (2015).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  27. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339, 452-456 (2013).
  28. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat Methods. 7, 717-719 (2010).
  29. Szymborska, A., et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  30. Pertsinidis, A., et al. Ultrahigh-resolution imaging reveals formation of neuronal SNARE/Munc18 complexes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 2812-2820 (2013).
  31. Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc Natl Acad Sci. 109, 13978-13983 (2012).
  32. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  33. Balla, T., Várnai, P. Visualization of Cellular Phosphoinositide Pools with GFP-Fused Protein-Domains. Curr Protoc Cell Biol. 24, 24 (2009).
  34. Xu, C., Watras, J., Loew, L. M. Kinetic analysis of receptor-activated phosphoinositide turnover. J Cell Biol. 161, 779-791 (2003).
  35. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 6, 153-159 (2009).
  36. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging. Nature Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  37. Zhang, M., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 727-729 (2012).
  38. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  39. Dyachok, O., Isakov, Y., Sågetorp, J., Tengholm, A. Oscillations of cyclic AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells. Nature. 439, 349-352 (2006).
  40. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 18519-18524 (2013).
  41. Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
  42. Morone, N., et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J Cell Biol. 174, 851-862 (2006).
  43. Peters, K. R., Carley, W. W., Palade, G. E. Endothelial plasmalemmal vesicles have a characteristic striped bipolar surface structure. J Cell Biol. 101, 2233-2238 (1985).
  44. Fujita, A., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Takenawa, T., Fujimoto, T. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9256-9261 (2009).
  45. Durisic, N., Laparra-Cuervo, L., Sandoval-Álvarez, &. #. 1. 9. 3. ;., Borbely, J. S., Lakadamyali, M. Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nat Methods. 11, 156-162 (2014).
  46. Thomas, C. L., Steel, J., Prestwich, G. D., Schiavo, G. Generation of phosphatidylinositol-specific antibodies and their characterization. Biochem Soc Trans. 27, 648-652 (1999).
  47. Várnai, P., Balla, T. Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains. Methods. 46, 167-176 (2008).
  48. Honigmann, A., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate clusters act as molecular beacons for vesicle recruitment. Nature Struct Mol Biol. 20, 679-686 (2013).

Tags

Single-molecule Super-resolution ImagingPhosphatidylinositol 45-bisphosphatePlasma MembraneFluorescent ProbesNanoscale DistributionPhosphoinositide SignalingHigh Spatial ResolutionDetergent-freePlasma Membrane Sheet PreparationPhosphoinositide LabelingSingle-molecule Fluorescence ImagingSingle-molecule LocalizationTIRF MicroscopySMLM

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Ji, C., Lou, X. Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes. J. Vis. Exp. (116), e54466, doi:10.3791/54466 (2016).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image