הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות
Summary
PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פלזמה ב ננומטר סולם .
Abstract
Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.
Introduction
Phosphoinositides לתרום חלק קטן של ליפידים קרום מוחלטים, אבל תפקיד קריטי במגוון של תהליכים תאיים. הם כוללים שבעה חברים נגזרו זירחון הפיך או dephosphorylation של הטבעות אינוסיטול על 3 rd, 4 וה 5 עמדות ה 1. Phosphatidylinositol 4-פוספט (PI4P) ו 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol (PI (4,5) P 2) הם שני phosphoinositides העיקריים שפועלים יחסית באופן עצמאי כמו שומנים הקובע של קרום התא התא (PM) 2,3. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) הוא הרבה פחות בשפע מאשר PI4P ו PI (4,5) P 2, אבל יש לו פונקציות ייחודיות בתהליכים תאיים שונים כולל סרטן 4 וסוכרת 5. יש שומנים אלו אינטראקציות מולקולריות מורכבות עם effectors שלהם וחלבונים רבים אחרים. לכן, חשוב להבין את הארגון המרחבי של Pho אלהsphoinositides ב PM על בקנה מידה ננומטרי.
ראיות מצטברות הראו כי קומפלקסי חלבונים או אשכולות מולקולה בתחומי PM המוקפים יכולים לשמש איתות 6 נקודות חמות. לדוגמה, 1a syntaxin, חלבון מפתח המווסת היתוך קרום 7-9, מציג ארגון מצרר PM. להבדיל מן הקונצנזוס של ארגון אשכול 1a syntaxin, הפריסה המרחבית של phosphoinositides ב PM שנויה במחלוקת. PI (4,5) דפוסי התפוצה P 2 נע בין אחיד 10-12, כתמים גדולים 13,14, כדי צפוף אשכולות 14-18, תלוי סוגי תאים ושיטות הניסוי נעשה שימוש. הארגון המרחבי של PI (4,5) P 2 ברזולוציה גבוהה יותר הוא גם לא עקבי. מחקר באמצעות מגורה פליטת-דלדול (STED) מיקרוסקופיה 19 חשף מספר רב של PI צפופה (4,5) P 2 ננו-אשכולות (~ 73 ננומטר קוטר) בין הסדינים PM של PC-12 תאים 20 </sעד>. תוצאה זו שונה ממחקרים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הקפאה מהירים (EM) 21,22, גישה השומרת על מבנה PM השלם של תאי חיים הרבה יותר טוב מאשר קיבוע כימי. הלה הראה בריכות נפרדות של PI (4,5) P 2; PI המרוכז יחסית (4,5) P 2 בבורות caveolae ומצופות וכן התפלגות אחידה על אזור PM השטוח. יתר על כן, PI ננומטריים (4,5) P 2 ארגון בסדינים הממברנה עשוי להיות שונה בתאי חיים קבועים. העבודה האחרונה שלנו הנושא הזה חקר בשני תאים קבועים ולחיות INS-1 באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM) 23.
SMLM מבוסס על stochastically מיתוג בקבוצה קטנה בלבד של fluorophores בכל זמן נתון, כך יכול להיות מקומי fluorophores פרט עם דיוק גבוה. רבים גישות הדמיה סופר-רזולוציה פותחו באמצעות עקרונות דומים לעלות לגבול השתברות של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי, כזהים photoactivation מיקרוסקופיה לוקליזציה (PALM) 24, הקרינה מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation (FPALM) 25, מיקרוסקופיה אופטית שחזור סטוכסטיים (STORM) 26,27 ו STORM ישירה (dSTORM) 28. עם תמונה להחלפה או fluorophores photoactivatable (צבעים או חלבוני ניאון), טכניקות SMLM לאפשר למדענים מבנים ביולוגיים תמונה ברזולוציה ננומטר 24,29,30 עם וידאו שער בתאים חיים 31,32.
באמצעות PI (4,5) P 2 כדוגמה, הצגנו את הגישה SMLM לחקור את הפיזור ננומטריים של phosphoinositides על PM. התחום PH של PLCδ1 (δ1 פוספוליפאז C) שקושר במיוחד כדי PI (4,5) P 2 הוא בדיקה ומבוססת עבור PI הדמיה (4,5) P 2 חלוקת המשנה הסלולר דינמיקה 33,34 ב PM . גנטיים אנחנו תייגנו תחום זה עם שני חלבוני ניאון, PAmCherry1 35 iRFP 36 </sup> לייצר חלבון היתוך כפול צבע (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (איור 1A-B). PAmCherry1 משמש החללית photoactivatable של תחום PH עבור דקל iRFP משמש כאינדיקטור בכלל לזהות תאים transfected לפני רכישת PALM . אנחנו מיישמים בדיקת ניאון כפול צבע זה הדמית SMLM בין סדיני הממברנה הקבועים. עבור הדמית PALM חייה, אנו מתויגים mEOS3 37 במקום PAmCherry1 לתחום PH PLCδ1 ליצור חללית mEOS3.1-PH PLCδ1 ליעילות ובהירויות הפוטון הטוב שלו (איור 1 ג-ד).
הדמיה SMLM עם בדיקות הרומן אלה ראש ממשלת מפרישי אינסולין INS-1 תאים 38 חשף תיוג הומוגנית של PI (4,5) P 2 ברוב האזורים PM וכן PI מרוכז (4,5) P 2 microdomains כי מתערבבים בדלילות בתחומים PM שטוח וכמה מבנים דמויי filopodia 23. נההפצת noscale של PI (4,5) P 2 מספקת בסיס מבני חשיבה מחודש כיצד הוא מתפקד בתאים חיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפתרון בעיות, שני תהליכים צריכים תשומת לב נוספת: ייצור גיליון הממברנה קיבעון מדגם. כפי שתואר בפרוטוקול, זמן הדגירה של coverslips בשלב 1.1.6 חשוב לייצור גיליון הממברנה. זמן דגירה אופטימלית תחת תנאי הניסוי שלנו הוא 7-10 דקות (איור 2). זמן רב יותר מאשר דגירת 10 דקות יהיה לייצר תאים שלמים במקום סדיני הקרום על coverslips PDL ו דגירה קצרה יוביל פחות או סדינים לא קרום על coverslips מצופה PDL. כפי שתואר בפרוטוקול, את fixatives וטמפרטורה במהלך קיבעון הם קריטיים לשמירה על חלוקת PI (4,5) P 2 PM. קיבוע ב RT או שימוש 4% -PFA לבדו יכול לעוות את חלוקת השומנים נורמלי PM.
על ידי יישום מיקרוסקופיה PALM קרום לחקר ליפידים, אנו מסוגלים לקיים את חלוקת בקנה מידה ננומטרי של PI (4,5) P 2, phosphoinositide מפתח שמתווך מכל יסוד פעילות הסלולר. פריסה המרחבית זה של PI (4,5) P 2 עם מילויי ריכוז מוגבלים בתאי INS-1 מספקת מסגרת חשיבה מחודשת אינטראקציות שומני חלבון ואירועי איתות מקומיות של PI (4,5) P 2 בתאים אלה. יתר על כן, על פי שיטה בעבודה זו יכולה לחול גם על מחקר פוספוליפידים בממברנה אחר עם בדיקות נכונות, ובכך, מתן כלי רומן ללמוד phosphoinositides בתהליכים ביולוגיים.
שימוש יריעות קרום בעבודה זו עוקף שני נושאים עיקריים מחקרים מורפולוגיים פוספוליפידים: טיפול דטרגנט וזיהום אות פוטנציאל מן cytosol. דטרגנטים לעיתים קרובות לגרום אשכולות ו אובדן משמעותי של אות פוספוליפידים PM. הזיהום של אות cytosolic הוא בעייתי במיוחד במקרה של phosphoinositides שפע הנמוך על 23 PM, כגון PI (3,4,5) P 3 ו PI (3,4) P 2. דגימות גיליון ממברנה מסוגלות circumvent הבעיות הללו מבלי לשבש מבנים משמעותיים הקשורים קרום הפלזמה, כגון meshwork יקטינו קליפת המוח ובורות מצופה clathrin 42,43. ההתפלגות הומוגנית היחסית של PI (4,5) P 2 PM היא בהסכם טוב עם מחקרי EM ההקפאה מהירים אחרים באמצעות GST-PH PLC בדיקות δ1 בקרום פיברובלסטים 44.
חשוב לציין כי תנאי עיבוד מדגם פסולים יכולים לייצר תוצאות מטעות. ראשית, חשוב לבצע את פעולות קיבעון בטמפרטורה נמוכה יותר (4 ° C) ולהשתמש מקבע GA לייצור גיליון הממברנה. כפי שניתן לראות בתרשים 3, טמפרטורה חמה קיבעון PFA ללא GA אינה מספיקה כדי לתקן phosphoinositides ב PM התא. זה יכול לעוות את PI בשלמותה (4,5) P 2 הפצה וליצור אשכולות חדו כי לא נצפו בתאים חיים בתנאים פיסיולוגיים. שנית, השימוש של PAmCherry1 כמולחקור את SMLM, ולא בדיקות אחרות, הוא מכריע הדמיה PALM כמותית. היתרון של יישום PAmCherry1 מגיע מנכסים צילום פיזי מולקולרי יחיד היטב מאופיין שלה 35,40,45, כגון בהירות, יעילות צילום הפעלה גבוהה יותר מכל, מוגבלת מאוד צילום מהבהב. מאפיינים אלה מאפשרים לנו לחסל חפצי אשכול פוטנציאליים צילום המהבהב וכמותית לנתח את הצפיפות המולקולרית של PI הממברנה (4,5) P 2.
גישה זו גם יש מגבלות. ראשית, שיטת גיליון הקרום השתמשה במחקר זה לא תחקה את חלוקת פיזיולוגיים מלאה של PI (4,5) P 2 כי התא מופר לפני ההדמיה. עם זאת, הדמית PALM לחיות שלנו מציגה את חלוקת הומוגנית יחסית דומה של PI (4,5) P 2, תומכות התוצאות שנצפו עם דגימות וכו הממברנה. שנית, כפי שדנו בעבודה הקודמת שלנו 23, SMLM דורש מומחיות הדמיה מיותר על חיפושtention להימנע חפצי הדמיה שעלולה להתעורר מתהליכים שונים, כוללים הבדיקות בשימוש, הכנת מדגם קיבעון, דגימת תמונה ושחזור. לבסוף, על פי בדיקות המבוססות על תחומי PH ונוגדנים היו בשימוש נרחב במחקרי phosphoinositide 46,47 אפשריים עדיין לא שכל PI (4,5) P 2 בקרום ניתן לאתרם באמצעות גישה זו. לדוגמא, PI (4,5) P 2 מחויבי חלבונים אנדוגניים אחרים עשוי לא להיות נגיש בדיקות PH או נוגדנים, וזה עלול לגרום הערכה נמוכה מדי של PI (4,5) P 2 בשל הפרעת השטח של לחקור את עצמם. דרך חלופית של PI תיוג (4,5) P 2 תהיה באמצעות Top-פלואוריד PI (4,5) P 2 48, אנלוגי P 2 מראש שכותרתו PI (4,5) עם שינוי על הזנב של המקורי PI (4,5) P 2. עם זאת, ניתן להמיר במהירות לתוך תת phosphoinositide אחרות של חילוף החומרים בתא חי מהר מאז טבעת אינוסיטול שלה זהה endogenouPI של (4,5) P 2. זה מעלה את החשש אם PI מראש שכותרתו זה (4,5) אנלוגי P 2 בתאים חיים יכול לייצג נאמנה PI (4,5) P 2 ולא מוצרים מטבולית שלה. לכן, למרות מספר מגבלות, בדיקות המבוססות על תחומי PH עדיין בין הבדיקות הטובות ביותר כי כבר בשימוש נרחב כדי לפקח PI (4,5) הפצת P 2 ודינמיקה על ראש ממשלת תאים.
היישום העתידי של מתודולוגיה זו ניתן להרחיב את לימודי phosphoinositide אחרים, כגון PI (3,4,5) P 3 ו PI (3,4) P 2. לסיכום, גישת SMLM הרומן משמשת כאן פותחת דרכים חדשות ללמוד phosphoinositide בתאים. באמצעות PI (4,5) P 2 כדוגמה, אנחנו מדגימים את המאפיינים הייחודיים של הדמיה PALM במחקר מורפולוגי וכמותית של מולקולות קרום התא, כמו גם חסרונות. גישה זו ניתן להתאים מולקולות אחרות של אינטרסים יהיו יישומים רחבים בביולוגיה של תא.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).
Materials
| Microscope | Nikon | Ti-U | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
| High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405nm: 15 mW & 13 mW; 488nm: 45 mW & 42 mW; 561nm: 45 mW & 40 mW; 640nm: 35 mW & 16 mW. |
| 100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm | |
| Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) | Nikon | ||
| Matlab | MathWorks | ||
| Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18mm coverslip, #1.5 |
| Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
| Lipofectamin 3000(transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
| PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
| secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
| Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
| magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
| temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
| EGTA | Sigma | 3780 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | 223506 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M9272 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |
Referenzen
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, 651-657 (2006).
- Hammond, G. R. V., et al. PI4P And PI(4,5)P(2) Are Essential But Independent Lipid Determinants Of Membrane Identity. Science. 337, 727-730 (2012).
- Nakatsu, F., et al. PtdIns4P synthesis by PI4KIIIalpha at the plasma membrane and its impact on plasma membrane identity. J Cell Biol. 199, 1003-1016 (2012).
- Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science. 296, 1655-1657 (2002).
- Czech, M. P. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol. 65, 791-815 (2003).
- Spira, F., et al. Patchwork organization of the yeast plasma membrane into numerous coexisting domains. Nat Cell Biol. 14, 640-648 (2012).
- Barg, S., Knowles, M. K., Chen, X., Midorikawa, M., Almers, W. Syntaxin clusters assemble reversibly at sites of secretory granules in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20804-20809 (2010).
- Sieber, J. J., et al. Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science. 317, 1072-1076 (2007).
- Knowles, M. K., et al. Single secretory granules of live cells recruit syntaxin-1 and synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) in large copy numbers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20810-20815 (2010).
- Milosevic, I., et al. Plasmalemmal phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate level regulates the releasable vesicle pool size in chromaffin cells. J Neurosci. 25, 2557-2565 (2005).
- van Rheenen, J., Jalink, K. Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale. Mol Biol Cell. 13 (2), 3257-3267 (2002).
- Hammond, G., Schiavo, G., Irvine, R. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinct cellular pools of PtdIns4P and PtdIns (4, 5) P2. Biochem J. 422, 23-35 (2009).
- Huang, S., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-rich plasma membrane patches organize active zones of endocytosis and ruffling in cultured adipocytes. Mol Cell Biol. 24, 9102-9123 (2004).
- James, D. J., Khodthong, C., Kowalchyk, J. A., Martin, T. F. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates SNARE-dependent membrane fusion. J Cell Biol. 182, 355-366 (2008).
- Laux, T., et al. GAP43, MARCKS, CAP23 modulate PI(4,5)P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 149, 1455-1472 (2000).
- Aoyagi, K., et al. The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdomains at syntaxin clusters. J Biol Chem. 280, 17346-17352 (2005).
- Kabachinski, G., Yamaga, M., Kielar-Grevstad, D. M., Bruinsma, S., Martin, T. F. CAPS and Munc13 utilize distinct PIP2-linked mechanisms to promote vesicle exocytosis. Mol Biol Cell. 25, 508-521 (2014).
- Wang, J., Richards, D. A. Segregation of PIP2 and PIP3 into distinct nanoscale regions within the plasma membrane. Biol Open. 1, 857-862 (2012).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
- van den Bogaart, G., et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions. Nature. 479, 552-555 (2011).
- van Rheenen, J., Achame, E. M., Janssen, H., Calafat, J., Jalink, K. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. Embo J. 24, 1664-1673 (2005).
- Sato, K., et al. Differential requirements for clathrin in receptor-mediated endocytosis and maintenance of synaptic vesicle pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1139-1144 (2009).
- Ji, C., Zhang, Y., Xu, P., Xu, T., Lou, X. Nanoscale Landscape of Phosphoinositides Revealed by Specific Pleckstrin Homology (PH) Domains Using Single-molecule Superresolution Imaging in the Plasma Membrane. J of Biol Chem. 290, 26978-26993 (2015).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339, 452-456 (2013).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat Methods. 7, 717-719 (2010).
- Szymborska, A., et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Pertsinidis, A., et al. Ultrahigh-resolution imaging reveals formation of neuronal SNARE/Munc18 complexes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 2812-2820 (2013).
- Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc Natl Acad Sci. 109, 13978-13983 (2012).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Balla, T., Várnai, P. Visualization of Cellular Phosphoinositide Pools with GFP-Fused Protein-Domains. Curr Protoc Cell Biol. 24, 24 (2009).
- Xu, C., Watras, J., Loew, L. M. Kinetic analysis of receptor-activated phosphoinositide turnover. J Cell Biol. 161, 779-791 (2003).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 6, 153-159 (2009).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging. Nature Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Zhang, M., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 727-729 (2012).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Dyachok, O., Isakov, Y., Sågetorp, J., Tengholm, A. Oscillations of cyclic AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells. Nature. 439, 349-352 (2006).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 18519-18524 (2013).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Morone, N., et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J Cell Biol. 174, 851-862 (2006).
- Peters, K. R., Carley, W. W., Palade, G. E. Endothelial plasmalemmal vesicles have a characteristic striped bipolar surface structure. J Cell Biol. 101, 2233-2238 (1985).
- Fujita, A., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Takenawa, T., Fujimoto, T. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9256-9261 (2009).
- Durisic, N., Laparra-Cuervo, L., Sandoval-Álvarez, &. #. 1. 9. 3. ;., Borbely, J. S., Lakadamyali, M. Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nat Methods. 11, 156-162 (2014).
- Thomas, C. L., Steel, J., Prestwich, G. D., Schiavo, G. Generation of phosphatidylinositol-specific antibodies and their characterization. Biochem Soc Trans. 27, 648-652 (1999).
- Várnai, P., Balla, T. Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains. Methods. 46, 167-176 (2008).
- Honigmann, A., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate clusters act as molecular beacons for vesicle recruitment. Nature Struct Mol Biol. 20, 679-686 (2013).
