Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

1. Hoja de Preparación de membrana y fijación Preparar hojas de membrana marcadas con IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 Prepare el ADN plásmido que codifica IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 usando técnicas de biología molecular convencionales. Las células en 1,5 Cultura # 1 INS-18 mm cubreobjetos redondos pre-recubierto con 30 mg / ml de fibronectina a 50-70% de confluencia siguiente INS-1 protocolos estándar de cultivo celular 38,39. Transfectar las células un día después de que se alcanza de 50 a 70% de confluencia. Transfectar células con IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 usando el reactivo de transfección de liposomas siguiendo los protocolos del fabricante. Después de la transfección, permiten que las células crezcan durante 48 horas. En el día del experimento, los cubreobjetos de la capa (en un lado) con ~ 0,5 a 1 ml de 500 mg / ml de poli-D-lisina (PDL; diluyeron en dH 2 O) durante 1-2 horas. A continuación, escurrir PDL colocando un pañuelo de papel enel borde del cubreobjetos. Coloque el cubreobjetos en un (C 4 °) placa de metal enfriado previamente para su uso posterior. Lavar las células INS-1 pre-transfectadas que crecen en cubreobjetos con 0,5 ~ – solución salina tamponada con fosfato 1 ml de hielo frío (PBS) que contiene EGTA 1 mM. Repita el lavado tres veces y drenar PBS. Coloque los cubreobjetos con células cultivadas (células del lado mirando hacia abajo) sobre los cubreobjetos revestidos con PDL en una placa de metal pre-refrigerada con un par de pinzas. Deja la placa en un refrigerador (4 ° C) durante 7 – 10 minutos para permitir que las células se unan a los cubreobjetos recubiertos-PDL (Figura 2). NOTA: El tiempo de incubación debería estar en el intervalo de 7-10 min para una mejor unión de las células a la superficie recubierta-PDL. El entorno refrigerador es seco y la incubación no debe ser demasiado largo. Retire la placa metálica de la nevera. Despegue suavemente el portaobjetos que contiene las células pre-transfectadas utilizando pinzas. Esto produce una capa fina de lámina de membrana celular en elcubreobjetos PDL-revestido. Lave suavemente las hojas de membrana con ~ 0.5 – 1 ml de hielo frío PBS y luego fijar con ~ 0.5 – 1 ml de hielo-fría% de paraformaldehído al 4 (PFA) + 0,2% de glutaraldehído (GA) en PBS durante 15 min a 4 ° C. Precaución: El paraformaldehído y glutaraldehído son tóxicos. Manejarlos en una campana extractora con la piel y los ojos. Después de la fijación, la imagen de las hojas de membrana inmediatamente (ver sección 3) o almacenar en ~ 0.5 – 1 ml de PBS a 4 ° C. Nota: después de la fijación de la lámina de membrana, no habrá unión de las sondas de pH del citosol a la PI (4,5) P 2 equilibrio. Las sondas de pH unidas se disocian gradualmente a partir de la hoja de la membrana y se difunden en la solución (aunque podría tomar días o semanas). Por lo tanto, se recomienda a la imagen las muestras fijadas justo después de la preparación de muestras. Preparar láminas de membrana para PI (4,5) P etiquetado anticuerpo específico 2 Cultura INS-1 en las células de # 1.5, 18 mm cubreobjetos redondos pre-recubiertas con 30 &# 181; g / ml de fibronectina al 50% -70% de confluencia. transfectar células con ADN de plásmido al día siguiente, como se describe en el paso 1.1.3. Repetir los pasos desde 1.1.4 a 1.1.7 como se describe anteriormente. NOTA: Realice los siguientes procedimientos a 4 ° C. Lavar los cubreobjetos que contienen hojas fijas PM tres veces con ~ 0.5 – 1 ml de PBS enfriado con hielo que contiene 50 mM NH4Cl. Saciar las hojas con 0,5 ~ – borohidruro de sodio 1 ml de 0,1% en PBS durante 7 minutos, y lavar con ~ 0,5 – 1 ml de PBS (sin 50 mM NH 4 Cl). Bloquear las muestras con ~ 0,5 – 1 ml de solución de bloqueo (solución de PBS que contiene 5% (v / v) suero normal de cabra, 5% (v / v) de albúmina de suero bovino y 50 mM NH 4 Cl) durante 45 min. A continuación, se incuba con ~ 0,5 – 1 ml PI primaria (4,5) P 2 anticuerpo (dilución 1: 300) en solución de bloqueo durante 1 hr. Lavar tres veces (10 min cada vez) con ~ 0,5 – 1 ml de PBS que contenía 50 mM NH4Cl. Incubar las muestras con ~ 0,5 – 1 ml secundario F (ab ') 2 de cabra-anti-ratónanticuerpo conjugado con fluoróforos (1: 300) en tampón de bloqueo durante 1 hr. Lavar tres veces con ~ 0.5 – 1 ml de PBS. muestras post-fix con 4% PFA + 0,2% GA durante 15 min, a continuación, lavar las muestras tres veces con PBS (7 min cada vez). Proceda a la Sección 3 para obtener imágenes o almacenar en ~ 0,5 ~ 1 ml de PBS a 4 ° C para su uso posterior. NOTA: Preparar las muestras a 4 ° C. Utilice PFA al 4% + 0,2% GA fijador para preservar la distribución fisiológica de fosfoinosítidos en la PM. Preparación RT o fijación con 4% PFA solo pueden causar artefactos significativos (Figura 4). 2. Cultivo de células Preparación de Células vivas imágenes con mEOS3.1-PH PLC δ1 Preparar el plásmido de ADN que codifica la δ1 mEOS3.1-PH PLC como se describió anteriormente 23. Cultura INS-1 en las células de # 1.5 18 mm cubreobjetos ronda pre-recubierto con 30 mg / ml de fibronectina hasta que alcanzan el 50% y el 70% confluency siguiente estándar INS-1 protocolos de cultivo celular 38,39. El día siguiente, transfectar células INS-1 con el mEOS3.1-PH PLC δ1 plásmido de ADN usando el reactivo de transfección de liposomas siguiendo el protocolo del fabricante. Incubar durante 48 horas antes de exponer. 3. PALM Adquisición de imágenes de láminas de membrana y las células vivas PALM adquisición de imágenes de hojas de membrana NOTA: Aquí, un sistema SMLM fluorescencia de reflexión total interna (TIRF) microscopio base (aceite de 100X, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 se utiliza para toda la adquisición de imagen. Antes de imágenes, diluir 1 l de solución de bolas fluorescentes en 10 ml de PBS + 50 mM MgCl 2. Añadir 200 l solución diluida en las muestras de células cámara de imágenes que contienen (de pasos 1.1.8 / 1.2.6) para 10 min. A continuación, lavar con PBS tres veces. Iniciar el sistema de imágenes de palma. En el software de imagen asociado, seleccione el "canal IRFP y# 34; botón (642 nm de excitación láser, 700/75 nm de emisión). Encuentra la membrana celular que expresa las sondas de pH en el canal IRFP. NOTA: La lámina de membrana debe tener una perla fluorescente cerca. Esto es necesario para la corrección de la deriva después. Utilice el botón "Capture" para recoger una imagen TIRF convencional de la membrana celular en el canal IRFP como referencia para la futura reconstrucción de la imagen. Establecer un ángulo TIRF normal (es decir, después de alcanzar el ángulo crítico, a su vez otros 1,5 grados) escribiendo en 2140 en el ajuste de ángulo de imagen TIRF. Utilice esta configuración para todos los pasos salvo indicación en contrario ángulo. NOTA: En el sistema TIRF se describe aquí, 3.500 es el ángulo vertical hacia arriba, 2.200 es el ángulo crítico TIRF, y 2140 es el ángulo TIRF normal, que es de 1,5 grados más después de TIRF ángulo crítico. El ángulo TIRF estrecho se menciona a continuación en 3.2.3 es 2,120, que es otro grado 2 después de alcanzar ángulo crítico TIRF. Cambiar al canal PAmCherry1 haciendo clic THe Botón de canal RFP (561 nm de excitación, 600/50 filtro de emisión nm). Ajuste la barra de desplazamiento en la almohadilla "AOTF" todo el camino hacia la derecha para tener iluminación potencia de láser de 561 nm durante 10-20 segundos para blanquear la fluorescencia de fondo de la membrana. Ponga el ajuste óptimo de la cámara (binning 2×2) en la pestaña "Formato" y el protocolo de adquisición rápida en la pestaña "ND adquisición de secuencia" (típicamente 10.000-40.000 imágenes a 20 Hz). Iniciar la adquisición de imágenes PAmCherry1 (561 nm láser a plena potencia, 50 ms / frame) con la activación simultánea de láser de 405 nm en un nivel bajo (0,1% – 1%) haciendo clic en el botón "Ejecutar ahora". Ajustar la intensidad de 405 nm láser de modo que los puntos individuales espacialmente aisladas de cada cuadro son fácilmente identificables. NOTA: El número de moléculas PAmCherry1 activables disminuye gradualmente durante la adquisición. 405 nm intensidad del láser debe aumentarse gradualmente para mantener la densidad óptima de las señales de moléculas individuales en cadamarco. Continuar la adquisición de imágenes hasta que se active ninguna señal PAmCherry1 sola molécula. PALM imágenes de células vivas Antes de imágenes, diluir perlas fluorescentes en la cámara de imagen durante 10 minutos como se describe en el paso 3.1.1. A continuación, iniciar la imagen PALM abriendo el software de imagen asociada. NOTA: Utilice una cámara de imágenes de liberación rápida magnética para obtener imágenes de células vivas. Mantener el centro del campo de la imagen a 35 ° C con un controlador de temperatura bajo perfusión constante con tampón extracelular (extracelular Solución: NaCl 135 mM, KCl 5,6 mM, 2,6 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl 2, glucosa 3 mM y 20 mM HEPES; pH = 7,3). Elija el botón de canal GFP (525/50 nm de emisión). Identificar la membrana celular que expresa sondas fluorescentes basado en fluorescente verde de mEOS3 bajo excitación láser 488 nm. Asegúrese de que las perlas fluorescentes En las cercanías también se incluyen durante la exploración, ya que se requiere más adelante para fuera de línea dricorrección de pies. Haga clic en el botón de "captura" para recoger una imagen TIRF de la membrana celular en mEOS3 canal (verde) como imagen de referencia. Use un evanescente iluminación de excitación de onda superficial (después de alcanzar el ángulo crítico, a su vez otros 2 grados) escribiendo en 2120 en el ajuste de imágenes de células vivas ángulo TIRF. NOTA: Esto minimiza la fluorescencia de la no unida mEos3-PH en el adyacente citosol a la membrana plasmática. Cambiar al "canal de RFP" botón (561 nm de excitación, emisión de 600/50 nm). Usa el poder de láser 561 nm completa para blanquear la fluorescencia de fondo de las hojas de membrana de 10 ~ 20 segundos con la barra de desplazamiento en el "cojín AOTF" (ver 3.1.4). Iniciar la adquisición de la imagen haciendo clic en el botón "Ejecutar ahora" en el canal rojo (561 nm plena potencia, fijado en 10 ms / marco de la "cámara" ajuste de pestaña) con la activación simultánea de láser de 405 nm. Ajustar la intensidad del láser de 405 nm para activar puntos separados espacialmenteen cada trama. NOTA: A medida que avanza la adquisición, ONU-convertido-PH mEOS3.1 PLC δ1 número molécula disminuye lentamente. Poco a poco aumentar la potencia del láser de 405 nm a optimizar la señal de una sola molécula. La longitud de adquisición de imágenes depende de la finalidad experimental. Adquirir imágenes de forma continua durante 5 min en condiciones normales. Si se requiere una adquisición más largo, recoger múltiples pilas de imágenes en lugar de un único gran pila, imagen. El tamaño de archivo de cada imagen pila no debe superar los 4 GB o afectará el análisis posterior del software. 4. SMLM Procesamiento de Imágenes y Reconstrucción La transferencia de los archivos de imagen (.tif pilas) a una estación de análisis de imágenes. El lanzamiento del programa de reconstrucción de imágenes (a medida escrito) en Matlab como se ha descrito previamente 37 y cargar la pila de imágenes haciendo clic en la pestaña "Archivo" en el menú principal, luego "abrir", luego "archivo nuevo". Identificar y locaLIZE eventos moleculares individuales de cada cuadro. Establecer el filtrado de umbral de intensidad con un número de umbral (1-10) en la "onda". Compruebe los ajustes de los parámetros óptimos para la detección del punto visual antes de la reconstrucción. A continuación, vaya a la pestaña "PALM" y haga clic en "un proceso paso" para comenzar la reconstrucción de imágenes. NOTA: La intensidad umbral para la detección de punto es arbitraria y depende de la experiencia personal. Varios ensayos pueden ser necesarios para generar un umbral de detección óptima que ni recoge demasiados no cualificado (DIM) puntos ni filtra los demasiados puntos calificados (brillantes). Ajustar otros parámetros para optimizar el análisis de datos. En este caso, la distancia vecindario (puntos de fluorescencia en los marcos de vecinos dentro de una distancia son combinados) se establece como 65 nm (1/2 ancho de píxel) e instalado de forma una sola molécula. marcos Gap (eventos de moléculas individuales que se produjeron dentro de estos marcos y barrio distancia se combinaron y se monta como un evento único molécula) esestablecer como 26 marcos (1,3 seg) para imágenes PAmCherry1 40. Ajuste estos parámetros de acuerdo con las propiedades de las sondas de una sola molécula y la tasa de adquisición para evitar la sobre-contando 40 en SMLM. Aplicar corrección de la deriva con perlas fluorescentes durante las reconstrucciones. Para obtener imágenes de las láminas de membrana fijas marcadas por IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, reconstruir el conjunto de pilas de imágenes a partir de la misma lámina de membrana de una sola imagen de super-resolución en 37. Para las muestras de células vivas marcadas por mEOS3.1-PH PLC δ1, separar toda la pila de imágenes en varios lotes más pequeños de 1.000 fotogramas de forma que la pila de 1,000 consecutiva marco se reconstruye una sola imagen de super-resolución, que tiene una resolución temporal de tan 10 seg. Al final, se combinan todas las imágenes de la serie de tiempo en la pila de series de tiempo final de 23. NOTA: En las imágenes en vivo de células PALM, un pequeño número de sondas activadas puede mover o disociarsede PI (4,5) P2 en la tarde antes del blanqueo. Para tener en cuenta el sobremuestreo de las sondas, combinar señales de moléculas individuales en las tramas de vecinos dentro de 130 nm (en lugar de 65 nm) en un suceso de emisión única durante el análisis de la imagen. Después de la obtención de las imágenes reconstruidas, llevar a cabo un análisis más detallado de imagen con el programa personalizado escrito en Matlab para cuantificar la densidad de la molécula, la densidad de micro-dominio tamaño, y análisis / cluster con par-41 de correlación.