Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

1. Scheda membrana Preparazione e fissaggio Preparare fogli di membrana etichettati con IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 Preparare il DNA codifica plasmide IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 utilizzando tecniche standard di biologia molecolare. Cultura INS-1 le cellule su # 1.5 18 mm coprioggetto tondo pre-rivestito con 30 ug / ml fibronectina al 50-70% di confluenza seguente INS-1 protocolli standard di coltura cellulare 38,39. Trasfezione delle cellule un giorno dopo viene raggiunto dal 50 al 70% di confluenza. Cellule trasfezione con IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 utilizzando liposomi reagente di trasfezione seguendo protocolli del produttore. Dopo trasfezione, permettono alle cellule di crescere per 48 ore. Il giorno dell'esperimento, coprioggetto cappotto (su un lato) con ~ 0.5 – 1 ml della 500 ug / ml poli-D-lisina (PDL, diluiti in dH 2 O) per 1-2 ore. Poi scolare PDL mettendo un carta velina suil bordo del vetrino. Posizionare i coprioggetti su una (C 4 °) piastra metallica pre-raffreddata per un uso successivo. Lavare pre-transfettate cellule INS-1 che crescono su vetrini con ~ 0,5-1 ml ghiacciata PBS (PBS) contenente 1 mM EGTA. Ripetere il lavaggio tre volte e scarico PBS. Posizionare il coprioggetto con cellule in coltura (cella sul lato rivolto verso il basso) sui vetrini PDL-rivestito su una lastra di metallo pre-raffreddata con un paio di pinzette. Lasciare il piatto in frigorifero (4 ° C) per 7 – 10 minuti per consentire alle cellule di allegare ai vetrini PDL rivestite (Figura 2). NOTA: Il tempo di incubazione dovrebbe essere nell'intervallo di 7 – 10 min per una migliore attacco delle cellule alla superficie PDL rivestite. L'ambiente frigorifero è asciutto e incubazione non dovrebbe essere troppo lungo. Rimuovere la piastra metallica dal frigorifero. Delicatamente staccare il vetrino contenente le cellule pre-trasfettate con una pinzetta. Questo produce un sottile strato di foglio di membrana cellulare sullavetrino PDL-rivestito. lavare delicatamente i fogli di membrana con ~ 0,5-1 ml ghiacciata PBS e poi fissare con ~ 0,5-1 ml ghiacciata% paraformaldeide 4 (PFA) + 0,2% glutaraldeide (GA) in PBS per 15 minuti a 4 ° C. Attenzione: Paraformaldeide e glutaraldeide sono tossici. gestirli in una cappa aspirante con la pelle e protezione per gli occhi. Dopo la fissazione, l'immagine dei fogli di membrana immediatamente (vedere paragrafo 3) o conservare in ~ 0,5-1 ml di PBS a 4 ° C. NOTA: Dopo aver sistemato il foglio di membrana, non ci sarà alcun legame di sonde PH dal citoplasma al PI (4,5) P2 equilibrio. Le sonde PH legati gradualmente dissociarsi dal foglio di membrana e diffondere nella soluzione (anche se potrebbe richiedere giorni o settimane). Pertanto, si raccomanda di immagine i campioni fissati subito dopo la preparazione del campione. Preparare fogli di membrana per PI (4,5) P2 specifica etichettatura degli anticorpi Cultura INS-1 celle # 1.5, 18 mm coprioggetto tondo pre-rivestito con 30 &# 181; g / ml fibronectina al 50% -70% di confluenza. cellule trasfezione con DNA plasmidico il giorno successivo come descritto al punto 1.1.3. Ripetere i passaggi da 1.1.4 a 1.1.7 come descritto sopra. NOTA: Eseguire le seguenti procedure a 4 ° C. Lavare i coprioggetti contenenti fogli PM fisse per tre volte con ~ 0,5-1 ml ghiacciata PBS contenente 50 mM NH 4 Cl. Placare i fogli con ~ 0,5 – boroidruro di sodio 1 ml di 0,1% in PBS per 7 minuti, e lavare con ~ 0,5 – 1 ml di PBS (senza 50 mM NH 4 Cl). Bloccare i campioni con ~ 0,5 – 1 ml soluzione bloccante (soluzione PBS contenente 5% (v / v) di siero normale di capra, 5% (v / v) albumina di siero bovino e 50 mM NH 4 Cl) per 45 min. Poi, incubare con ~ 0,5 – 1 ml PI primario (4,5) P 2 anticorpo (1: 300 diluizione) in soluzione bloccante per 1 ora. Lavare tre volte (10 min) di volta in volta con ~ 0,5 – 1 ml di PBS contenente 50 mM NH 4 Cl. Incubare i campioni con ~ 0,5 – 1 ml secondaria F (ab ') 2-capra-anti-topoanticorpi coniugati con fluorofori (1: 300) in tampone di bloccaggio per 1 ora. Lavare tre volte con ~ 0,5-1 ml di PBS. campioni post-fix 4% PFA + 0,2% GA per 15 minuti, poi lavare campioni tre volte con PBS (7 min ogni volta). Procedere alla Sezione 3 per l'imaging o conservare in ~ 0,5 ~ 1 ml di PBS a 4 ° C per un uso successivo. NOTA: Preparare i campioni a 4 ° C. Utilizzare 4% PFA + 0,2% GA fissativo per preservare la distribuzione fisiologica del fosfoinositidi nel PM. RT preparazione o di fissazione con 4% PFA sola possono causare artefatti significativi (Figura 4). 2. Preparazione coltura cellulare per live-cell imaging con mEOS3.1-PH PLC δ1 Preparare il plasmide DNA codificante il δ1 mEOS3.1-PH PLC come descritto in precedenza 23. Cultura INS-1 le cellule su # 1.5 18 millimetri rotonda coprioggetto pre-rivestita con 30 ug / ml di fibronectina fino a raggiungere il 50% -70% ConfLuency seguente INS-1 protocolli standard di coltura cellulare 38,39. Il giorno seguente, trasfezione le cellule INS-1 con il mEOS3.1-PH PLC δ1 plasmide DNA utilizzando liposomi reagente di trasfezione seguendo il protocollo del produttore. Incubare per 48 ore prima di imaging. 3. PALM Acquisizione di immagini di fogli di membrana e cellule vive PALM acquisizione di immagini di fogli di membrana NOTA: Qui, una riflessione di fluorescenza interna (TIRF) sistema basato SMLM microscopio totale (olio 100X, APO, NA = 1,49, WD 0,12 millimetri) 23 viene utilizzato per tutti l'acquisizione delle immagini. Prima di imaging, diluire 1 ml di soluzione di perline fluorescenti in 10 ml di PBS + 50 mM MgCl 2. Aggiungere 200 ml diluito soluzione nei campioni di cellule contenenti camera di imaging (da passaggi 1.1.8 / 1.2.6) per 10 min. Poi, lavare con PBS per tre volte. Avviare il sistema di imaging PALM. Nel software di imaging associato, selezionare il "canale IRFP &# 34; tasto (642 nm laser di eccitazione, 700/75 nm di emissione). Trova la membrana cellulare che esprime sonde PH nel canale IRFP. NOTA: Il foglio membrana deve avere un tallone fluorescente nelle vicinanze. Questo è necessario per la correzione della deriva tardi. Utilizzare il pulsante "cattura" per raccogliere un'immagine TIRF convenzionale della membrana cellulare in canale IRFP come riferimento per la futura ricostruzione dell'immagine. Impostare un angolo TIRF normale (vale a dire, dopo aver raggiunto l'angolo critico, girare un altro 1,5 gradi) digitando nel 2140 in un angolo TIRF impostazione per l'imaging. Utilizzare questa impostazione per tutte le fasi, salvo diversa indicazione angolo. NOTA: Nel sistema TIRF qui descritto, 3500 è l'angolo verticale fino, 2200 è l'angolo critico TIRF e 2140 è l'angolo TIRF normale, che è 1,5 gradi più dopo TIRF angolo critico. L'angolo TIRF stretto di seguito indicate in 3.2.3 è 2120, che è un altro 2 gradi dopo aver raggiunto TIRF angolo critico. Passare al canale PAmCherry1 cliccando °pulsante del canale RFP e (561 nm di eccitazione, 600/50 filtro per le emissioni nm). Regolare la barra di scorrimento nel pad "AOTF" tutta la strada per il diritto di avere il potere di illuminazione piena di laser 561 nm per 10-20 secondi per sbiancare la fluorescenza di fondo membrana. Impostare l'impostazione ottimale della telecamera (binning 2×2) nella scheda "Formato" e il protocollo di acquisizione veloce nella scheda "acquisizione sequenza ND" (tipicamente 10,000-40,000 immagini a 20 Hz). Inizia l'acquisizione di immagini PAmCherry1 (561 nm laser a piena potenza, 50 msec / telaio) con contestuale attivazione del laser 405 nm ad un livello basso (0,1% – 1%), facendo clic sul pulsante "Esegui ora". Regolare l'intensità del laser 405 nm in modo che spazialmente isolati singoli punti in ogni frame sono facilmente identificabili. NOTA: Il numero di molecole PAmCherry1 attivabili diminuisce gradualmente durante l'acquisizione. 405 nm intensità del laser dovrebbe essere gradualmente aumentata per mantenere la densità ottimale dei singoli segnali molecola in ciascunatelaio. Continuare fino a quando l'acquisizione di immagini viene attivato alcun segnale PAmCherry1 singola molecola. l'imaging PALM in cellule vive Prima di imaging, diluire perline fluorescenti nella camera di imaging per 10 minuti come descritto al punto 3.1.1. Quindi avviare l'imaging PALM aprendo il software di imaging associato. NOTA: Utilizzare un magnetico a sgancio rapido camera di imaging per l'imaging dal vivo di cellule. Mantenere il centro del campo dell'imaging a 35 ° C con un regolatore di temperatura sotto costante perfusione con tampone extracellulare (extracellulare Soluzione: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl 2, 1.2 mM MgCl 2, 3 mM di glucosio, e 20 mM HEPES, pH = 7.3). Scegliere il pulsante del canale GFP (525/50 nm di emissione). Identificare la membrana cellulare che esprime sonde fluorescenti in base fluorescente verde da mEOS3 sotto 488 nm eccitazione laser. Assicurarsi che perline fluorescenti nelle vicinanze sono inclusi anche durante l'imaging come questo sono necessari in seguito per dri in lineaCorrezione ft. Fare clic sul pulsante "Capture" per raccogliere un'immagine TIRF della membrana cellulare in mEOS3 (verde) canale come immagine di riferimento. Utilizzare un superficiale evanescente illuminazione d'onda di eccitazione (dopo aver raggiunto l'angolo critico, girare un altro 2 gradi) digitando nel 2120 in un angolo TIRF impostazione per l'imaging dal vivo di cellule. NOTA: Questo minimizza la fluorescenza dal non legato mEos3-PH nella adiacente citosol alla membrana plasmatica. Passare al "canale di RFP" pulsante (561 nm di eccitazione, 600/50 nm di emissione). Utilizzare la piena potenza del laser 561 nm di candeggina fluorescenza di fondo dei fogli di membrana per 10 ~ 20 sec con la barra di scorrimento nella "pad AOTF" (vedi 3.1.4). Inizia l'acquisizione di immagini facendo clic sul pulsante "Esegui ora" nel canale rosso (561 nm piena potenza, fissato a 10 msec / frame nella "camera" impostazione scheda), con contestuale attivazione del laser 405 nm. Regolare l'intensità del laser 405 nm per attivare punti spazialmente separatiin ogni frame. NOTA: Come procede di acquisizione, un convertito mEOS3.1-PH PLC δ1 numero molecola diminuisce lentamente. Aumentare gradualmente la potenza del laser 405 nm per ottimizzare il segnale singola molecola. La lunghezza acquisizione immagini dipende dallo scopo sperimentale. Acquisire immagini in modo continuo per 5 minuti in condizioni normali. Se è necessaria una acquisizione più lungo, raccogliere più pile di immagini al posto di un unico, grande serie di immagini. La dimensione del file di ogni pila di immagini non deve superare i 4 GB o interesserà l'analisi del software in seguito. 4. SMLM Image Processing e la ricostruzione Trasferire i file di immagine (.tif immagine pile) a una stazione di analisi delle immagini. Avviare il programma di ricostruzione delle immagini (su scritta) in Matlab come descritto in precedenza 37 e caricare la pila di immagini facendo clic sulla scheda "File" nel menu principale, quindi "aperto", quindi "nuovo file". Identificare e LocaLize singoli eventi molecolari da ogni fotogramma. Impostare filtraggio soglia intensità con un numero di soglia (1-10) nella "wavelet". Verificare le impostazioni dei parametri ottimali per il rilevamento punto visivamente prima della ricostruzione. Poi vai alla scheda "PALM" e fare clic su "un processo graduale" per avviare la ricostruzione delle immagini. NOTA: soglia di intensità per la rilevazione punto è arbitraria e dipende dall'esperienza personale. Diversi studi può essere richiesto di generare una soglia di rilevamento ottimale che ne raccoglie troppi non qualificato (dim) punti e dell'elemento filtrante troppo molti punti qualificati (chiaro). Regolare gli altri parametri per ottimizzare l'analisi dei dati. Qui, la distanza quartiere (punti di fluorescenza nei fotogrammi vicini all'interno di una distanza vengono combinati) è impostato come 65 nanometri (1/2 larghezza in pixel) e montato come una singola molecola. telai Gap (eventi singoli molecola che si sono verificati all'interno di queste cornici e quartiere distanza sono stati combinati e montato come un singolo evento molecola) èimpostato come 26 fotogrammi (1,3 sec) per l'imaging PAmCherry1 40. Regolare questi parametri in base alle proprietà di sonde di singola molecola e la velocità di acquisizione per evitare un eccesso di conteggio 40 in SMLM. Applicare correzione della deriva con perline fluorescenti durante le ricostruzioni. Per l'imaging i fogli di membrana fissi etichettati da IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, ricostruire l'intero stack di immagini provenienti dallo stesso foglio di membrana di una singola immagine super-risoluzione 37 in. Per campioni di cellule vive etichettati da mEOS3.1-PH PLC δ1, separano l'intera pila di immagini in diversi piccoli stack di 1.000 fotogrammi in modo che pila 1,000 consecutivi-frame viene ricostruita come immagine super-risoluzione singolo, che ha una risoluzione temporale 10 sec. Alla fine, combinare tutte le immagini serie temporali nella serie pila tempo finale 23. NOTA: In immagini PALM live-cella, un piccolo numero di sonde attivati ​​può muovere o dissociarsida PI (4,5) P 2 nel PM prima sbianca. Per spiegare il sovracampionamento delle sonde, si combinano i segnali singola molecola nei fotogrammi vicini all'interno di 130 nm (invece di 65 nm) in un unico evento di emissione durante l'analisi delle immagini. Dopo aver ottenuto le immagini ricostruite, effettuare ulteriori analisi di immagine con il programma personalizzato scritto in Matlab per quantificare la densità molecola, la densità micro-dominio / dimensioni, e l'analisi cluster con coppia di correlazione 41.