Latente Groei Remming Assay aan de kwantificering van bacteriën afgeleide Antimicrobials over het mededingingsbeleid

De volgende werkwijze is aangepast aan 7,8 concurrent stammen testen met inhibitor producerende stammen. LET OP: Dit protocol houdt aerosol generatie met bacteriële culturen. Dit kan alleen worden uitgevoerd in een ingeperkte ruimte bij de uitvoering van lokaal goedgekeurde veiligheidsoverwegingen. Sproeien van de kweek op de agar platen bij een niveau 2 veiligheidskast wordt vervuiling van de agarplaten en het omringende milieu te minimaliseren. Dit zal ook de onderzoeker van aerosol inhalatie van de bespoten bacteriën te beschermen, is dit een belangrijk punt van zorg als de onderzoeker is het gebruik van containment level 2 organismen. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen. De omgeving van de petrischaal wordt best bedekt met wegwerp absorberend weefsel. Post-nevel ontsmetting met behulp van UV-licht wordt geadviseerd. 1. Voorbereiding van de Agar Plates Bereid je hersenen het hart infusie (BHI) agar in overeenstemming met de manubrikant's instructies. Autoclaaf de BHI agar bij 121 ° C, 15 psi gedurende 20 min, of volgens de aanbevelingen autoclaaf fabrikant te steriliseren. Giet 15 ml porties van gesteriliseerde BHI agar in steriele Petrischalen en laten stellen. OPMERKING: elke agarplaat voor gebruik in de assay afkomstig uit dezelfde voorraad agar en dat er evenveel agar in elke plaat. Dit beperkt de variatie in beschikbare nutriënten en remmer diffusie tussen platen waardoor vergelijkbaarheid. 2. Voorbereiden Steriele Bouillon BHI bouillon bereiden volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 10 ml porties van 28 ml BHI tot universele glazen flessen. Autoclaaf de BHI bouillon bij 121 ° C, 15 psi gedurende 20 min, of volgens de aanbevelingen autoclaaf fabrikant te steriliseren. LET OP: Zorg ervoor dat alle bouillon gebruikt in de test is afkomstig van dezelfde partij bouillon autoclaved tegelijkertijd de variatie in voedingsstoffen die variatie in resultaten kunnen leiden beperken. 3. Het voorbereiden Steriel Vaporizer Bottle (s) Demonteer de vapourizer fles. Spray 5% oppervlakte-actieve reinigingsmiddel door de vapourizer interne verontreinigingen te elimineren, genieten van de vapourizer fles, deksel en vapourizer in de 5% oppervlakte-actieve reinigingsmiddel 's nachts. LET OP: Handschoenen en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gebruikt bij de behandeling van oppervlakte-actieve reinigingsmiddel. Droog de verdamper, deksel en flessen onder steriele luchtstroom kap. Vul de fles met 70% ethanol, bevestig vapourizer en spuit een deel van de ethanol door de vapourizer. Doe het deksel op de verdamper en bewaren met de ethanol tot gebruik binnen. Direct voorafgaand aan het gebruik, aseptisch spoel de fles met steriele BHI bouillon en spuit de bouillon door de vapourizer. LET OP: Dit voorkomt dat de ethanol affecterende het inoculum aan de fles toegevoegd in paragraaf 6.3. 4. Voorbereiding van de Bacteriële Overnight Culture (s) Streak de deelnemer en remmer stammen op een steriele BHI agar plaat en incubeer bij 37 ° C aëroob gedurende ongeveer 18 uur (overnacht). Opmerking: Deze plaat vormt een voorraad van bacteriën die kunnen worden gebruikt voor meerdere herhalingen binnen dezelfde week indien bewaard bij 4 ° C. Inoculeer 10 ml steriel BHI bouillon met een enkele kolonie van de gewenste deelnemer bacteriestam in een 28 ml flesje universeel. Incubeer de universele fles bij 37 ° C aëroob gedurende de nacht door schudden bij 250 rpm in een rondschudapparaat. 5. Spot Cultuur van de Inhibitor-producerende Isoleren Bereid de kweek van een nacht (s) zoals beschreven in paragraaf 4. Zorg ervoor agarplaten helemaal droog zijn, zonder condensatie op het deksel, voorafgaand aan de inenting (bijvoorbeeld door incubatie plate gedurende 60 minuten bij 37 ° C); dit voorkomt dat het inoculum zich verspreidt over de plaat van de inoculatie plaats. Pipetteer 25 ul van de overnachtkweek op het midden van de agar platen. Vermijd het volledig indrukken van de pipet zuiger om luchtbellen die cultuur spuiten over de agar te voorkomen. Laat de kweek gedroogd bij kamertemperatuur om de verspreiding van de kweek beperken. Incubeer de agar platen bij 37 ° C aëroob gedurende de nacht. 6. Voorbereiding van de Spray Inoculum van de Test Concurrent Strain (s) Bereid de overnacht cultuur zoals beschreven in paragraaf 4. Verdun de kweek gedurende de nacht 10-voudige in BHI bouillon tot ongeveer 4 x 10 6 CFU ml -1 geven, en een opschorting van de OD 600 0,3 ± 0,05. LET OP: Een 10-voudige verdunning zal niet opgeven 4 x 10 6 CFU ml -1 voor alle soorten bacteriën, het berekenen van de benodigde verdunningsfactor door spread plating seriële verdunningen tussen 1 x 10 <sup> -1 -1 x 10 -6. Giet de verdunde cultuur in een steriele plastic parfum verstuiver fles. Opmerking: Het totale volume moet meer dan nodig is om het aantal agarplaten spuit. Ongeveer 250 ul per plaat is geschikt voor een 9 cm diameter Petrischaal. 7. Uitgestelde Groeiremming Assay Spuit de cultuur door elk van de verdamper flessen dat de cultuur in de sproeimechanisme geladen vóór sproeien op de agar. Van een afstand van ongeveer 15 cm boven de agar, spuit ongeveer 250 gl verdunde kweek (3 sprays van een typische 50 ml vaporizer) over het gehele oppervlak agar. Incubeer de agar platen bij 37 ° C aëroob gedurende de nacht. Herhalen voor andere platen met hetzelfde aantal sprays. 8. Interpretatie Uitgestelde groeiremming testresultaten Meet de groeiremming zone van de gespoten concurtor stam (Figuur 1A – C, "X" aan "X") in millimeter, aftrekken van de diameter van de centrale vlek van de remmer-producent (Figuur 1A – C, "Y" naar "Y"). LET OP: Figuur 1E laat zien hoe deze gegevens kunnen worden gepresenteerd Noteer de duidelijkheid score voor remmingszones. LET OP: Dit geeft de mate van remming waargenomen. Voorbeelden zijn getoond in Figuur 1A – D, stammen die kunnen worden gebruikt voor standaardisering zijn in de resultaten representatief gedeelte voorgesteld. De volgende schaal kan worden gebruikt voor de duidelijkheid scoring: een helderheid score van 0 tot een zone van volledige groeiremming van de concurrent stam beschrijven. Een score van 1 tot een zone van bijna volledige groeiremming beschrijven slechts individuele kolonies in de zone van clearing. Een score van 2 tot en met een zichtbare zone van verminderde groei te beschrijven, groei binnen deze zone is convloeiend of nabij samenvloeiing maar verminderde dichtheid met> 50%. Een score van 3 tot slechts minimale groeireductie beschrijven confluente groei en verminderd met minder dan 50%, een zone is nog steeds zichtbaar en meetbaar. Een score van 4 tot en met geen zichtbare remming van de groei te beschrijven. Een score van 5 beschrijven dat de groei van de deelnemer stam werd verhoogd in de nabijheid van de test-inhibitor producerende stam. Zie Figuur 1 voor voorbeelden. Deze scores zijn subjectief aan de experimentator. 9. repliceert Herhaalde tests althans biologische drievoud om de reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten te bepalen. LET OP: Als herhalingen worden uitgevoerd op verschillende dagen, nemen metingen en scoren platen onmiddellijk na verwijdering uit de incubatie, vervolgens winkel platen bij 4 ° C of neem hoge kwaliteit foto's van de platen voordat u ze weggooien. Opslag of foto's van platen maakt een eenvoudige vergelijking van de resultaten tussen de verschillende dagen, tzijn van bijzonder belang voor het bevestigen reproduceerbare scoren in dagen / experimenten. Wees ervan bewust dat de opslag van de platen heeft de potentie om resultaten te veranderen. LET OP: Voor duidelijke foto's plaats platen rechtop zonder hun deksel op een mat zwarte achtergrond in een gebied van diffuus licht, maken gebruik van een hoge resolutie camera (≥8 MP) die in staat zich te concentreren op voorwerpen dicht bij de lens (macromodus). Als alternatief kunnen sommige gel imagers met trans-hulplicht ingesteld op wit licht van hoge kwaliteit, zeer reproduceerbare beelden te produceren.