Latente Growth Inhibition Assay zur Quantifizierung der Wirkung von Bakterien abgeleitete Antimikrobielle auf Wettbewerb
Summary
The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Abstract
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Introduction
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein kritischer Schritt dieses Bakterienart Wettbewerb Protokoll , das es von anderen unterscheidet, ist die Inkubation über Nacht des Inhibitors vor der Zugabe des Kompetitors Isolat isolieren. Der Inhibitor Stamm benötigt diese Wachstumsperiode inhibitorischen Verbindungen herzustellen. Als Kompetitor Belastung auf dem gleichen Medium überlagert wird, ermöglicht dieses Verfahren die Forscher das volle Potential zu beobachten des Inhibitors Stamm mit einem Wachstum des Wettbewerbers Belastung zu stören. Als Ergebnis spiegelt dieser Test, was mit der Natur geschieht; ein Isolat ist vollständig in einer Nische eingerichtet, und die andere müssen alle hemmenden Variablen entgegenzuwirken können der Lage sein, um erfolgreich die Nische eindringen.
Es gibt zwei Teile zu diesem Protokoll, die am ehesten zu fehlerhaften Ergebnissen führen, wenn nicht richtig durchgeführt wird. Zum einen kann unvollständige Sterilisation der Verdampfer Flaschen einführen Bakterien in den Test zu kontaminieren. IncuBation der Brühe verwendet, um den Verdampfer Flasche in Schritt 3.6 in ein steriles Gefäß zu spülen können Flaschen verwendet werden, vollständig sterilisiert, um zu bestätigen wurden. Zusätzliche Wäschen in desinfizierenden Lösungen, wie Virkon kann vor der Wäsche in oberflächenaktiven Reinigungsmittel verwendet werden, beschrieben in Schritt 3.2, ob zusätzliche Sterilisation erforderlich ist.
Ein zweiter Schritt, der zu falschen Ergebnissen führen kann, ist die Verdünnung des Wettbewerbers Stamm (Schritt 6.1). Wenn die Verdünnung nicht optimal, klare Messungen der Hemmung ist nicht leicht bestimmt werden. Dieser Test wurde unter Verwendung verschiedener Isolate nasal optimiert als Inhibitor produzierenden Stämme in einem breiten Spektrum von Gram-positive und Gram-negative Spezies im Vergleich zu S. aureus SH1000 als Wettbewerber Stamm 7,8. Es wurde anschließend unter Verwendung von verschiedenen Koagulase negative und Koagulase-positive Staphylokokken als Wettbewerber getestet und Inhibitor-produzierenden Stämme. Bei der Prüfung von Gattungen andere als die oben als Wettbewerber beschriebenStamm, einige Optimierung der Verdünnung des Inokulums kann notwendig sein.
Wenn Klarheit Partituren signifikant zwischen den Wiederholungen variieren, könnte es notwendig sein, den Wettbewerber Stamm Inokulum zu standardisieren, indem es auf eine bestimmte optische Dichte einstellen. Das wird jedoch die Zeit, die der Test einzurichten dauert, und wird wahrscheinlich die Zahl der Stämme zu reduzieren ist es möglich, pro Experiment zu verarbeiten. Optisch Einstellen der Kultur auf einen entsprechenden OD ein McFarland-Standard eine schnelle Alternative zur Verfügung stellen kann.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass es nur zu kultivierbaren Bakterien angewendet werden. Aus diesem Grund viele Studien verwenden 16S rRNA – Sequenzierung Konkurrenzausschluss Wechselwirkungen 3,4,13 zu prognostizieren. Allerdings genetische und Metagenom-Techniken können nur Mitglieder der Gemeinschaft auf Artenebene zu unterscheiden, und / oder berücksichtigen keine besondere innerartliche Merkmalsvariation. Es ist möglich, dass die Zuordnung eines particul zu screenenar Gen , das ein Merkmal mit der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Bakterienspezies codiert 5, jedoch erfordert dieses Vorwissen eines Gens wahrscheinlich unter Ausschluss zugeordnet werden einer Spezies.
Ein Sicherheitsaspekt dieser Technik ist, dass aufgrund der Aerosolerzeugung von Bakterien, kann es nur in Laboratorien mit einem Level 2 Sicherheitsschrank oder mit ähnlichen Sicherheitsvorkehrungen verwendet werden. Es gibt alternative Techniken für den Wettbewerb zwischen den Isolaten zu testen, die für intraspezifische Merkmalsvariation berücksichtigen und erzeugen keine Aerosole von Bakterien. Ein solches Verfahren ist die gleichzeitige Antagonismus – Test 2. In diesem Verfahren wird ein Inokulum von einem Isolat auf einer Agarplatte verteilt, und ein zweites Isolat Inokulum wird auf getüpfelt oder gestochen, sobald die erste getrocknet ist. Dies würde eine Umgebung, wo die Stämme im direkten Wettbewerb (gleichzeitige Antagonismus) erzeugen, die beide im Wettbewerb hemmende Verbindungen herzustellen und scavenge Nährstoffe zuerst. Die advantage des latenten Wachstumshemmung Assays über die gleichzeitige Antagonismus-Test ist, dass der Inhibitor-Isolat immer den Wettbewerbsvorteil ist voll etabliert, bevor Invasion des Konkurrenten Isolat haben sollte. Dies ist mehr reflektiert , was in der Umgebung passieren würde, wie in den meisten Nischen, wird ein Isolat hergestellt werden , bevor ein anderer Stamm hinzugefügt wird, anstatt zwei Isolate gleichzeitig 8 hinzugefügt wird.
Eine weitere Alternative zur Vermeidung von Aerosolerzeugung von Bakterien, die die Wettbewerber in Top-Agar isolieren hinzuzufügen wäre, die anstatt über den Inhibitor-Isolat gesprüht werden gegossen könnte. das Volumen der Top-Agar jedoch müssten hinzugefügt etwa 3 ml werden gleichmäßige Abdeckung der Platte zu gewährleisten. Innerhalb dieses Bandes würde die Kompetitor-Isolat nicht auf dem gleichen Medium wie dem Inhibitor Isolat wachsen, so würde nicht von reduzierten Nährstoffe leiden. Der Wettbewerber würde auch nicht mit irgendwelchen hemmenden Verbindungen in direktem Kontakt until sie in die Top-Agar diffundiert. Ein solcher Test nicht als aktive latente Hemmung oder gleichzeitige Antagonismus beschrieben werden könnte.
Ein ähnliches Verfahren wurde früher verwendet, um die Niveaus von Bacitracin Widerstand unter klinischen S. beurteilen aureus – Isolaten 10. Der wesentliche Unterschied zwischen dem Protokoll hier beschrieben und die von 10 beschrieben wurde , ist die letztere nur Klein Wettbewerber Stämme als sensibel (komplett inhibition- Klarheit Score 0) oder beständig (teilweise bis gar keine inhibition- Klarheit Score 1-5). Der latente Wachstumshemmung Assay könnte daher auch für die Höhe der Widerstand an die Erzeuger von bestimmten antimikrobiellen Mitteln zu screenen, verwendet werden, oder auch für neuartige antimikrobielle Substanzen wirksam gegen multiresistente Erreger zu suchen.
Es wurde vorgeschlagen , dass die Host – Mikroflora 9 unerwünschte Mitglieder der Bakteriengemeinschaft zu beseitigen manipuliert werden könnte. Die Anwendung von Corynebakterien oder Staphylococcus epidermidis wurden bereits S. gezeigt zu beseitigen aureus Besiedlung in den Nasenlöchern in einem erheblichen Teil der Bevölkerung 11,12. Studien in bestimmte Stämme, die kompetitiv unerwünschte Mitglieder der Wirts Flora, durch Techniken wie die hier beschriebene ausschließen kann, kann daher auf zukünftige Therapeutika führen.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCM wird von einem BBSRC-IPA-Auszeichnung mit Unilever Plc (BB / L023040 / 1) gefördert. HAG wird von einem saudi-arabische Ministerium für Höhere Bildung PhD studentship finanziert.
Materials
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
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