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Biologie

Croissance différée Essai d'inhibition pour quantifier l'effet des bactéries dérivées Antimicrobiens sur la concurrence

Published: September 03, 2016
doi:
10.3791/54437
, , ,
1Institute of Integrative Biology,University of Liverpool

Summary

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Abstract

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

Introduction

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.

Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.

The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.

Protocol

La méthode suivante est adaptée pour tester des souches 7,8 concurrent avec des souches productrices d'inhibiteur. NOTE: Ce protocole implique la production d'aérosols avec des cultures bactériennes. Cela ne peut être réalisé dans un espace confiné avec la mise en œuvre des considérations de sécurité localement approuvés. La pulvérisation de la culture sur les plaques d'agar-agar dans une enceinte de sécurité de niveau 2 à minimiser la contamination des plaques d'agar-agar et le milieu environnant. Cela permettra également de protéger le chercheur de l'inhalation d'aérosols des bactéries pulvérisées, ceci est une préoccupation majeure si le chercheur utilise un niveau de confinement 2 organismes. équipement de protection individuelle approprié doit être porté. La zone entourant la boîte de Pétri est mieux recouverte d'un tissu absorbant jetable. décontamination post-pulvérisation en utilisant la lumière UV est conseillé. 1. Préparation des plaques d'agar Préparer la perfusion cardiaque du cerveau (BHI) agar conformément à la fabriles instructions cant. Autoclave l'agar BHI à 121 ° C, 15 psi pendant 20 minutes, ou selon les recommandations du fabricant autoclave, à stériliser. Verser 15 ml aliquotes de gélose BHI stérilisée dans des boîtes de Pétri stériles et laisser durcir. REMARQUE: Assurez-vous chaque plaque de gélose à être utilisé dans le test provient du même stock d'agar et qu'il y a la même quantité de gélose dans chaque plaque. Cela limite la variabilité des nutriments disponibles et inhibiteur de diffusion entre les plaques permettant la comparabilité. 2. Préparation stérile Broth Préparer un bouillon BHI conformément aux instructions du fabricant. Ajouter des aliquotes de 10 ml de BHI à 28 ml en verre bouteilles universelles. Autoclave le bouillon BHI à 121 ° C, 15 psi pendant 20 minutes, ou selon les recommandations du fabricant autoclave, à stériliser. REMARQUE: Veiller à tout le bouillon utilisé dans l'essai provient du même lot de bouillon autoclaved en même temps, afin de limiter la variation de nutriments qui pourraient provoquer des variations dans les résultats. 3. Préparation de bouteille stérile Vaporisateur (s) Démonter la bouteille de vaporisateur. Vaporiser 5% agent de nettoyage actif à travers la bouilleur pour éliminer les contaminants internes, faire tremper le bouilleur bouteille, couvercle et bouilleur dans la surface agent de nettoyage actif de 5% du jour au lendemain. NOTE: Les gants et les équipements de protection individuelle approprié doivent être utilisés lors de la manipulation agent de nettoyage actif. Sécher le vaporisateur, le couvercle et les bouteilles sous hotte à flux d'air stérile. Remplir la bouteille avec 70% d'éthanol, rattachez vaporisateur et vaporiser un peu de l'éthanol à travers le vaporisateur. Mettez le couvercle sur le vaporisateur et le stocker avec l'éthanol à l'intérieur jusqu'à l'utilisation. Immédiatement avant utilisation, aseptique rincer la bouteille avec le bouillon de BHI stérile et pulvériser le bouillon à travers le vaporisateur. NOTE: Ceci empêche le aff d'éthanolète l'inoculum ajouté à la bouteille dans la section 6.3. 4. Préparation de la culture bactérienne Nuit (s) Streak le concurrent et l'inhibiteur des souches sur une plaque de gélose BHI stérile et incuber à 37 ° C aérobies pendant environ 18 heures (la nuit). NOTE: Cette plaque produit un stock de bactéries qui peuvent être utilisées pour de multiples répétitions au sein de la même semaine lorsqu'elles sont conservées à 4 ° C. Inoculer 10 ml de bouillon BHI stérile avec une seule colonie de la souche bactérienne concurrent requise dans un flacon de 28 ml universel. Incuber la bouteille universelle à 37 ° C en aérobiose nuit en agitant à 250 tours par minute dans un agitateur orbital. 5. spot Culture de l'Isolat Inhibitor produisant Préparer la culture (s) pendant la nuit, comme décrit à la section 4. Veiller à des plaques d' agar sont complètement sèches, sans condensation sur le couvercle, avant l'inoculation (par exemple en incubant plate pendant 60 min à 37 ° C); ce qui empêche l'inoculum de se propager à travers la plaque à partir du site d'inoculation. Introduire à la pipette 25 ul de la culture d'une nuit sur le centre des plaques d'agar-agar. Enfoncer complètement éviter le piston de la pipette pour éviter que des bulles d'air qui pulvérisent la culture à travers l'agar. Laisser la culture sécher à la température ambiante pour limiter la propagation de la culture. Incuber les plaques de gélose à 37 ° C en milieu aérobie pendant une nuit. 6. Préparation de la pulvérisation de l'inoculum de la souche d'un compétiteur de test (s) Préparer la culture de la nuit , comme décrit dans la section 4. Diluer la nuit culture 10 fois dans un bouillon BHI pour donner environ 4 x 10 6 CFU ml -1, et une suspension de 600 OD 0,3 ± 0,05. NOTE: Une 10 fois la dilution ne donnera pas 4 x 10 6 CFU ml -1 pour toutes les espèces bactériennes, calculer le facteur de dilution nécessaire par la propagation de placage des dilutions en série entre 1 x 10 <sup> -1 -1 x 10 -6. Verser la culture diluée dans un flacon de parfum vaporisateur plastique stérile. REMARQUE: Le volume total doit être supérieur à celui nécessaire pour le nombre de plaques d'agar-agar pulvérisé. Environ 250 pi par plaque est adapté pour un diamètre boîte de Pétri de 9 cm. 7. Croissance différée Essai d'inhibition Pulvériser la culture à travers chacune des bouteilles de vaporisateur pour faire en sorte que la culture est chargé dans le mécanisme de pulvérisation avant la pulvérisation sur la gélose. A partir d'une distance d'environ 15 cm au-dessus de la gélose, vaporiser environ 250 pi de culture diluée (3 pulvérisations d'un type de 50 ml vaporisateur) sur toute la surface de la gélose. Incuber les plaques de gélose à 37 ° C en milieu aérobie pendant une nuit. Répéter pour d'autres plaques avec le même nombre de pulvérisations. 8. Interprétation différés Résultats inhibition de la croissance Assay Mesurer la zone d'inhibition de croissance du concur pulvérisétor souche (figure 1A – "X" C, à "X") en millimètres, en soustrayant le diamètre de la tache centrale de l'inhibiteur-producteur (Figure 1A – C, "Y" à "Y"). REMARQUE: La figure 1E montre comment ces données pourraient être présentées Enregistrez le score de clarté pour les zones d'inhibition. NOTE: Ceci indique le degré d'inhibition observé. Des exemples sont montrés sur la figure 1A – D, les souches qui peuvent être utilisées pour la normalisation sont proposées dans la section des résultats représentatifs. L'échelle suivante peut être utilisée pour la clarté notation: un score de clarté de 0 pour décrire une zone d'inhibition complète de la croissance de la souche concurrent. Un score de 1 pour décrire une zone d'inhibition presque complète de la croissance, avec des colonies uniquement individuelles présentes dans la zone de compensation. Un score de 2 pour décrire une zone visible de croissance réduite, la croissance dans cette zone est concouramment ou presque confluente mais réduit la densité de> 50%. Un score de 3 à décrire que la réduction de la croissance minimale, la croissance est confluentes et réduite de moins de 50%, une zone est toujours visible et mesurable. Un score de 4 pour décrire l'absence d'inhibition visible de la croissance. Un score de 5 à décrire que la croissance de la souche concurrente a été augmentée à proximité de la souche d'inhibiteur produisant test. Voir la figure 1 pour des exemples. Ces scores sont subjectifs à l'expérimentateur. 9. réplicats Répétition des essais, au moins en triple exemplaire biologique afin de déterminer la reproductibilité des résultats obtenus. NOTE: Si les répétitions sont effectuées sur différents jours, prendre des mesures et marquer des plaques immédiatement après le retrait de l'incubation, puis soit des plaques de magasin à 4 ° C ou prendre des photos de haute qualité de plaques avant de les jeter. Stockage ou photographies de plaques permet de comparer facilement les résultats entre les différents jours, tson est particulièrement important pour confirmer la notation reproductible à travers jours / expériences. Soyez conscient que le stockage des plaques a le potentiel de modifier les résultats. NOTE: Pour effacer les photos placer des plaques debout sans leur couvercle sur un fond noir mat dans une zone de lumière diffuse, utiliser un appareil photo haute résolution (≥8 MP) capable de se concentrer sur des objets proches de l'objectif (mode macro). Par ailleurs, certains imageurs de gel avec trans-illuminateur fixés à la lumière blanche peut produire de haute qualité, des images hautement reproductibles.

Representative Results

Les résultats d'analyse devraient être observables comme une différence dans la souche superposée concurrent à proximité du centre tacheté inhibiteur souche productrice (Figure 1). Ces différences peuvent être interprétées comme une inhibition complète (figure 1A), une inhibition partielle (Figure 1B et 1C), aucune inhibition (figure 1D) ou une association positive. Le laboratoire largement disponible souches S. epidermidis Tü3298 et S. epidermidis Rp62A, et S. epidermidis Rp62A et S. aureus Newman ont été utilisés dans les figures 1B et 1D , respectivement. Nous suggérons que ces souches pourraient être utilisées pour tester ce protocole. Selon les espèces testées, l'inhibition complète et l'inhibition partielle sont probablement le résultat de peptides antimicrobiens, des antibiotiques ou d'autres inhibito de croissance diffusiblers produits par la souche de l'inhibiteur de la production. L' inhibition partielle a également été liée à une réduction de la disponibilité des nutriments pour la souche concurrente en raison de l' absorption ou séquestrant des nutriments par la souche inhibiteur 6. Comparaison de la taille de la zone d'inhibition entre les différents isolats d'inhibiteur produisant testés par rapport à la même souche de concurrent indique des différences dans l'un des éléments suivants: la quantité d'agent antimicrobien produit par la souche productrice d'inhibiteur; la capacité de l'inhibiteur à se diffuser à travers les médias; le type d'inhibiteur produit et le niveau de la souche concurrente aux inhibiteurs de résistance étant produite. Comparaison de la taille de la zone d'inhibition entre les différentes souches testées contre des concurrents de la même souche productrice d'inhibiteur est une indication du niveau des souches concurrent de l'inhibiteur étant produit de la résistance. <p class="jove_content" fo:keep-together.w-page = "SEIN" "1"> Les résultats varient en fonction de la souche inhibitrice utilisée et la souche utilisée concurrent. Répétitions en utilisant la même souche inhibitrice et concurrent devraient idéalement avoir le même score de clarté (décrite dans la section 8.2), ce qui indique une bonne technique a été utilisée tout au long. Si une application incohérente des bactéries a eu lieu les plaques ne doivent pas être utilisés. Par exemple, si la culture de compétiteur d'essai est trop diluer la zone d'inhibition apparaît plus grande et avec un bord moins clairement défini que ce qui est généralement observé (figure 2A); cela affecterait la fiabilité des mesures de la zone de comparaison. Si la tache de souche inhibiteur produisant n'a pas été complètement séché avant une nuit d' incubation, la souche inhibiteur est susceptible de se propager et non former une tache bien définie (figure 2B), qui affecte généralement les mesures de la zone , mais peut également affecter la notation de clarté. Si la souche de concurrentpas pulvérisé uniformément cela peut conduire à une répartition inégale des bactéries (figure 2C). Si la souche concurrent est trop concentré , il est possible que la souche concurrent peut se développer au – dessus de la souche d'inhibiteur (figure 2C), dans les cas extrêmes , cela peut conduire à une certaine inversion des rôles de contrainte concurrent / inhibiteur. Figure 1:. La gamme des résultats qualitatifs et quantitatifs qui peuvent être obtenus à partir du test d'inhibition de la croissance différée Résultats pour l'inhibition de la croissance peut varier de (A) une inhibition complète (score de 0), (B) inhibition partielle (score de 1) , (C) l' inhibition partielle (score de 2) à (D) aucune inhibition (score de 4). Les étiquettes indiquent les bords de croissance des souches d'inhibiteur (Y) et le bord extérieur de l'inhibitiondes zones (X). La taille de la zone d'intervalle d'inhibition de 0 mm à plus de 10 mm, comme illustré dans (E), qui montre les mesures pour les plaques photographiées en A, B, C et D. Les résultats sont présentés pour les souches de staphylocoques récentes (A , C) ou staphylococcique de laboratoire commun isolats S. epidermidis Tü3298 (inhibiteur) et S. epidermidis Rp62A (concurrent) (B), et S. epidermidis Rp62A (inhibiteur) et S. aureus Newman (concurrent) (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Exemples de résultats incohérents dus à une mauvaise technique Les résultats peuvent apparaître différemment que prévu si (A. </strong>) souche concurrent a été trop diluée, (B) souche inhibiteur n'a pas été complètement sec avant incubation / plaques n'étaient pas sec ou (C) si la souche de concurrent n'a pas été pulvérisé de manière uniforme et est trop concentré. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Une étape cruciale de ce protocole de la concurrence des espèces bactériennes qui le différencie des autres, est l'incubation pendant la nuit de l'inhibiteur isoler avant l' addition de l'isolat de concurrent. La souche inhibiteur nécessite cette période de croissance pour produire des composés inhibiteurs. Comme la souche concurrent est superposé au-dessus du même milieu, cette méthode permet au chercheur d'observer le plein potentiel de la souche inhibiteur d'interférer avec la croissance de la souche concurrent. Par conséquent, cet essai reflète ce qui se passe avec la nature; un isolat est pleinement établie dans une niche, et l'autre doit être capable de neutraliser toutes les variables inhibitrices pour être en mesure d'envahir avec succès le créneau.

Il y a deux parties à ce protocole qui sont les plus susceptibles d'entraîner des résultats erronés si elle est effectuée de manière incorrecte. Tout d'abord, la stérilisation incomplète des bouteilles de vaporisateur peut introduire des bactéries contaminantes dans le dosage. Incubation du bouillon utilisé pour rincer la bouteille de vaporisation à l'étape 3.6, dans un récipient stérile peut être utilisée pour confirmer les bouteilles ont été complètement stérilisé. lavages supplémentaires dans des solutions désinfectantes, comme Virkon, peuvent être utilisés avant le lavage en surface agent de nettoyage actif, décrit à l'étape 3.2, si la stérilisation supplémentaire est nécessaire.

Une deuxième étape qui peut entraîner des résultats erronés est la dilution de la souche concurrent (étape 6.1). Si la dilution ne sont pas optimales, des mesures précises de l'inhibition ne peuvent pas être facilement déterminées. Cet essai a été optimisée en utilisant différents isolats nasaux comme inhibiteur des souches productrices dans un large éventail d'espèces Gram-positives et Gram-négatives par rapport à S. aureus SH1000 comme souche concurrent 7,8. Il a ensuite été testé à l'aide de divers staphylocoques à coagulase négative et à coagulase positive en tant que concurrent et un inhibiteur des souches productrices. Lors du test de genres autres que ceux décrits ci-dessus comme le concurrentsouche, une certaine optimisation de la dilution de l'inoculum peut être nécessaire.

Si les scores de clarté varient considérablement entre les répétitions, il pourrait être nécessaire de normaliser la souche concurrent inoculum en la fixant à une densité optique spécifique. Cependant, cela va augmenter le temps le dosage nécessaire pour mettre en place, et est susceptible de réduire le nombre de souches, il est possible de traiter par expérience. ajuster visuellement la culture à une DO appropriée en utilisant un standard McFarland peut fournir une alternative rapide.

Une limitation de cette technique est qu'elle ne peut être appliquée aux bactéries cultivables. Voilà pourquoi de nombreuses études utilisent 16S séquençage ARNr pour prédire les interactions d'exclusion compétitive 3,4,13. Cependant, les techniques génétiques et métagénomiques ne peuvent distinguer les membres de la communauté au niveau de l'espèce, et / ou ne pas tenir compte de la variation particulière de trait intraspécifique. Il est possible de cribler pour l'association d'un particular gène qui code pour un trait à la présence ou l' absence d'une espèce bactérienne 5, mais cela nécessite une connaissance préalable d'un gène susceptible d'être associé à l' exclusion d'une espèce.

Un examen de cette technique de sécurité est que, en raison de la génération d'aérosol de bactéries, il ne peut être utilisé dans les laboratoires d'une enceinte de sécurité de niveau 2, soit avec des précautions de sécurité similaires. Il existe des techniques alternatives pour tester la concurrence entre les isolats qui représentent intraspécifique la variation des caractéristiques et ne génèrent pas d'aérosols de bactéries. Un tel procédé est l'antagonisme dosage simultané 2. Dans cette méthode, un inoculum d'un isolat est étalée sur une plaque de gélose, et un second inoculum d'isolat est repéré ou poignardé sur le dessus une fois que le premier a séché. Cela produirait un environnement où les souches sont en concurrence directe (antagonisme simultané), à la fois en compétition pour produire des composés inhibiteurs et piéger les nutriments en premier. Le Advantage du différé test d'inhibition de la croissance au cours du test de l'antagonisme simultané est que l'isolat d'inhibiteur doit toujours avoir l'avantage concurrentiel d'être pleinement établie avant l'invasion de l'isolat de concurrent. Ceci est plus le reflet de ce qui se passerait dans l'environnement, comme dans la plupart des niches, un isolat sera établi avant une autre souche est ajoutée, plutôt que deux isolats sont ajoutés en même temps 8.

Une autre alternative pour éviter la production d'aérosols de bactéries serait d'ajouter le concurrent d'isoler dans la gélose supérieure, ce qui pourrait être versé plutôt que pulvérisé sur l'isolat d'inhibiteur. Cependant, le volume de gélose ajoutée devrait être d'environ 3 ml pour assurer une couverture uniforme de la plaque. Dans ce volume, l'isolat concurrent ne serait pas de plus en plus sur les mêmes supports que l'isolat d'inhibiteur, donc ne souffrirait pas de nutriments réduits. Le concurrent ne serait également pas en contact direct avec des composés inhibiteurs until leur diffusion dans l'agar-agar en haut. Un tel essai ne peut pas être décrit comme l'inhibition différée ou simultanée antagonisme.

Une méthode similaire a déjà été utilisé pour évaluer les niveaux de résistance à la bacitracine chez S. clinique aureus 10. La principale différence entre le protocole décrit ici et qui a été décrit par 10, sont les dernières souches concurrentes uniquement classées comme sensibles (compléter la clarté inhibition- marquer 0) ou résistants (partielles pas de clarté inhibition- marquer 1-5). Le test d'inhibition de la croissance différée pourrait donc également être utilisé pour dépister les niveaux de résistance aux producteurs d'antimicrobiens particuliers, ou même à la recherche de nouveaux antimicrobiens actifs contre les agents pathogènes multirésistantes.

Il a été suggéré que la microflore de l' hôte peuvent être manipulées pour éliminer les éléments indésirables de la communauté bactérienne 9. Application de corynébactéries ou Staphylococcus epidermidis ont déjà été montré pour éliminer S. aureus colonisation dans les fosses nasales , dans une proportion significative de la population 11,12. Les études portant sur des souches spécifiques qui peuvent exclure la concurrence des membres indésirables de la flore d'accueil, grâce à des techniques telles que celle décrite ici, peut donc conduire à la thérapeutique à venir.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JCM est financé par une bourse BBSRC-IPA avec Unilever Plc (BB / L023040 / 1). HAG est financé par un saoudien Ministère de l'Enseignement supérieur PhD studentship.

Materials

Brain heart infusion broth Lab M lab049 rich general purpose media
agar-agar Merck Milipore 101614
petri dishes Sarstedt 82.1473.001
plastic perfume vaporizer not known – 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles no longer in production, alternative SLS BOT5006 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90 Decon  surface active cleaning agent 
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Referenzen

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Moran, J. C., Crank, E. L., Ghabban, H. A., Horsburgh, M. J. Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition. J. Vis. Exp. (115), e54437, doi:10.3791/54437 (2016).
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