الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية
Summary
Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.
Abstract
Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.
Introduction
مثيلة من قواعد السيتوزين في الحمض النووي (5mC) يمثل علامة جينية كبيرة وجدت في الجينوم الفقاريات المرتبطة النسخي إسكات 1. ويجري عرض 5mC والتي تحتفظ بها ميثيل الحمض النووي 2-5، وثبت أنها تلعب أدوارا هامة في عدد من العمليات البيولوجية بما في ذلك يطبع الجينومية، تعطيل كروموسوم اكس، والتمايز الخلوي، والتنمية 3 و 6. وبالتالي، فإن اختلال ويرتبط 5mC أنماط الجينومية مع عدد من الأمراض 7، 8-11. على الرغم من التقدم في فهم دور 5mC في التنمية والمرض، فإنه لا تزال مجهولة إلى حد كبير الطريقة التي يتم بها إزالة هذه العلامة في تطوير وأنسجة البالغين. وقد اقترحت عدة آليات محتملة لنزع الميثيل الحمض النووي مؤخرا بما في ذلك آليات الايجابي والسلبي نزع الميثيل 12، 13، 14، 15. ديسكفري لمنتجات 5mC الأكسدة متتابعة بوساطة-1011 النبات انزيماتوفاق (tet1 / 2/3) مثل 5 hydroxylmethylcytosine (5hmC)، 5-formylcytosine (5fC)، و 5 carboxylcytosine (5caC) في حقيقية النواة DNA 16، 17، 18، 19 ودفعت التكهنات عما إذا كانوا قد تكون وسيطة من عمليات نزع الميثيل الحمض النووي أو علامات جينية بمثابة مستقرة في حد ذاتها (13). في حين أن مظاهرة المكون من إصلاح الختان قاعدة، glycosylase الثايمين الحمض النووي (TDG) يمكن ربط وإزالة كل من 5fC و5caC من الحمض النووي 19، 20 يشير إلى وجود دور للمشتقات 5mC تعديل في نزع الميثيل الحمض النووي النشط. الأدلة الأخيرة تبين أن 5fC / 5caC يمكن أن تعدل معدل نقاط processivity RNA الثاني لتورط محتمل من هذه العلامات في تنظيم النسخي 29. ونظرا لهذه الأهمية البيولوجية المحتملة من أشكال المؤكسد من 5mC، وقد تم توظيف مجموعة من التقنيات الحيوية والأجسام المضادة القائمة على دراسة التوزيع الجيني والمحتوى العالمي 16، 19-24.
وبالنظر إلى أن معظم رانه الفقاريات الأجهزة تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا وأن توزيع قواعد السيتوزين المعدلة والأنسجة والخلايا من نوع محدد 16-18، 20، 23، 25-27، وتحديد التوزيع المكاني للمشتقات 5mC أكسدة في الأنسجة المختلفة تصبح مهمة تجريبية مهمة ضرورية لإزاحة الستار عن الوظائف البيولوجية. معظم النهج البيوكيميائية والأجسام المضادة على أساس لا توفر أي معلومات المكانية فيما يتعلق بتوزيع استمارات معدلة من 5mC في الأنسجة المختلفة، وخلية أنواع. في المقابل، يمكن أن تقنيات كيمياء المناعة أساس توفير أداة سريعة لتقييم التوزيع المكاني وتوطين النووية من 5mC 28 ومشتقاتها أكسدة لها 20. وقال إن وذكرت وفرة منخفضة جدا من 5fC (20 في كل 10 6 السيتوزين) و5caC (3 من كل 10 6 السيتوزين) في جينوم الفأر 18 تمثل تحديا كبيرا للكيمياء المناعة القياسية.
هنا،نحن تصف طريقة immunochemical حساسة للغاية التي توفر قوة والكشف السريع عن شكل المؤكسد من السيتوزين في أنسجة المخ لدى الثدييات. من خلال دمج الأجسام المضادة الثانوية البيروكسيديز مترافق إلى جانب خطوة تضخيم الإشارات، وهذه الطريقة تلتف تحديات الكشف عن كميات قليلة جدا من 5fC و5caC. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها للمشاركة في الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين مع علامات محددة النسب، واستكمال فعالية المناهج الأخرى في توضيح الوظائف البيولوجية لهذه علامات جينية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من وفرة منخفضة ذكرت المشتقات الأكسدة 5mC، 5fC و5caC في بعض الأنسجة سيقدم قيود كبيرة لبروتوكول كيمياء المناعة القياسية، إدراج الأجسام المضادة الثانوية البيروكسيديز مترافق سمح للكشف عن هذه التعديلات السيتوزين في الأنسجة الثابتة والخلايا (الشكل 2) . ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل فترة حضانة الأمثل مع حل tyramide تجريبيا لكل دفعة الفردية tyramide عدة إشارة التضخيم حيث لوحظ وجود علاقة خطية بين كثافة إشارة ومدة tyramide تضخيم الإشارات أساس، لمزيد من التفاصيل يرجى الرجوع إلى الميدا وآخرون. 2012 26 . وبالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة الإشارة / الخلفية يمكن أن تتعزز بشكل كبير من خلال تنفيذ يغسل في جرة Coplin للسماح إزالة فعالة من الأجسام المضادة الزائدة. وبعد الحضانة مع حل tyramide، من المهم التوقف فورا عن رد فعل عن طريق الغسيل في حل PBT إلى دتلوين الخلفية ecrease. فمن الأهمية بمكان عدم السماح المقاطع لتجف في أي وقت أثناء العملية.
كفاءة نزع البورينات الحمض النووي يمكن تحسينها من خلال تنفيذ رد فعل نزع البورينات عند 37 درجة مئوية. أثناء استخدام 4 N حمض الهيدروكلوريك بدلا من 2 N يعزز تلطيخ أشكال معدلة من 5mC باستخدام 4 N حمض الهيدروكلوريك لنزع البورينات الحمض النووي لن تسمح شارك في تلطيخ مع دابي، كما أنه يتفاعل بشكل حصري مع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل.
على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن توفر قوة التقييم نصف الكمية من أشكال معدلة من قواعد السيتوزين حيث كشفها، فإنه لا يمكن أن تستخدم لتقييم المستويات المطلقة لل5mC أو المشتقات الأكسدة. ولذلك، فإننا نوصي باستخدام البعض مكملة ولكن الكمية النهج 16، 19 -24. منذ اكتشاف المشتقات الأكسدة 5mC في جينوم الثدييات، تم وضع العديد من المداخل لدراسة الأدوار البيولوجية 16، 19-24. ورغم أن هذه approaالشطرنج يمكن أن تكون ذات قيمة في تحديد المستويات المطلقة للمشتقات الأكسدة 5mC، فإنها لا تقدم معلومات بشأن التوزيع المكاني من 20 و 26. وقد استخدمنا بنجاح الطريقة الموصوفة هنا لخريطة التوزيع المكاني وتوطين مشتقات الأكسدة 5mC في أنواع مختلفة من الخلايا من البلدان النامية والكبار الدماغ 20
من خلال الكشف عن التوزيع المكاني 20، يمكن أن هذه التقنية قد تكون حاسمة في فهم الآثار البيولوجية ومصير المشتقات المؤكسد من 5mC في مختلف السياقات البيولوجية حيث يمكن الكشف عن هذه المشتقات معدلة من 5mC بما في ذلك التمايز الخلوي والتنمية والمرض. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للطريقة وصفنا هنا تعطي التقييمات شبه الكمية للمشتقات المؤكسد من 5mC في الأنسجة المختلفة عن طريق تقييم حركية رد فعل البيروكسيديز (والذي يتناسب مع كثافة تلطيخ) في بعض الأحيان حضانة مختلفة مع tyramiدي 26.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).
Materials
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pPH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50 % in PBS |
| 0.01 % Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | PH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22x32mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
Referenzen
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer’s disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson’s disease patients’ brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington’s disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
