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Immunologie und Infektion

Implementazione di un sistema di infezione permeabile membrana Insert-based per studiare gli effetti di secrete batteriche tossine su cellule ospiti

Published: August 19, 2016
doi:
10.3791/54406
,
1Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health,University of Notre Dame

Summary

Qui, un metodo che utilizza un sistema di un'infezione inserto basato membrana permeabile per studiare gli effetti di Streptolisina S, una tossina secreta prodotta da streptococco di gruppo A, sui cheratinociti è descritto. Questo sistema può essere facilmente applicata allo studio di altre proteine ​​batteriche secrete con diverse tipologie cellula ospite durante l'infezione.

Abstract

Molti batteri patogeni secernono tossine potenti per aiutare nella distruzione del tessuto ospite, ad avviare modifiche alla segnaletica nelle cellule ospiti o di manipolare le risposte del sistema immunitario nel corso di infezione. Anche se i metodi sono stati sviluppati per purificare con successo e produrre molti di questi importanti fattori di virulenza, ci sono ancora molte tossine batteriche cui struttura unica o estesa modificazioni post-traslazionali le rendono difficili da purificare e studiare in sistemi in vitro. Inoltre, anche quando la tossina pura può essere ottenuto, ci sono molte sfide associate con studiare gli effetti specifici di una tossina in condizioni fisiologiche importanti. La maggior parte dei modelli di colture cellulari in vitro volti a valutare gli effetti delle tossine batteriche secrete sulle cellule ospiti coinvolgere incubando cellule ospiti con una dose di una volta di tossina. Tali metodi poco approssimano quello cellule ospiti in realtà esperienza durante un'infezione, in cui la tossina viene continuamente prodotto dacellule batteriche e lasciato accumulare gradualmente durante il corso dell'infezione. Questo protocollo descrive la progettazione di un sistema di infezione batterica basato inserto membrana permeabile per studiare gli effetti di Streptolisina S, un potente tossina prodotta da streptococco di gruppo A, su cheratinociti epiteliali umane. Questo sistema imita più da vicino l'ambiente fisiologico naturale durante un'infezione rispetto ai metodi in cui la tossina pura o supernatanti batteriche sono applicati direttamente alle cellule ospiti. È importante sottolineare che questo metodo elimina anche la polarizzazione di risposte dell'ospite che sono dovuti al contatto diretto tra i batteri e le cellule ospiti. Questo sistema è stato utilizzato per valutare efficacemente gli effetti di Streptolisina S (SLS) sull'integrità ospitante membrana, vitalità cellulare, e le risposte di segnalazione cellulare. Questa tecnica può essere facilmente applicata allo studio di altri fattori di virulenza secreti su una varietà di tipi di cellule di mammifero ospitante per studiare il ruolo specifico di un fattore batterica secreto durante il corso di infezione.

Introduction

La comprensione della funzione di fattori di virulenza batterica nel contesto di infezione cellula ospite è un obiettivo importante della ricerca patogenesi batterica. Molti batteri patogeni secernono attivamente tossine e altri fattori solubili per facilitare la distruzione del tessuto ospite, avviare le modifiche segnalazione in cellule ospiti o manipolare risposte del sistema immunitario nel corso dell'infezione 1 – 10. Sebbene metodi sono stati sviluppati per purificare successo e produrre molti di questi importanti fattori di virulenza di studio, alcuni prodotti batterici hanno strutture uniche o estese modificazioni post-traduzionali che li rendono candidati recalcitranti per metodi di purificazione e quindi non può essere studiata isolatamente utilizzando sistemi in vitro . Ad esempio, streptococco di gruppo A, il batterio patogeno responsabile di una miriade di infezioni che vanno dalla faringite alla fascite necrotizzante e la sindrome da shock tossico, produce un secretotossina batterica noto come Streptolisina S (SLS) 11 – 17. Questo peptide ribosomally prodotto è codificata dal gene cluster Streptolisina S associato (SAG), e il prodotto maturo è stimata in 2,7 kDa di dimensioni 14 – 17. Il protossina, codificata da Saga, si modifica post-traduzionale da diversi enzimi (SAGB, SAGC, e SAGD) per produrre la forma funzionale matura 15 – 17. La complessità di queste modificazioni post-traduzionali accoppiati con insolita sequenza aminoacidica della tossina hanno reso la tossina incompatibile con tutti gli sforzi delucidazione di purificazione e di struttura che sono state tentate fino ad oggi 15,17. Queste sfide hanno sforzi complicate per determinare il ruolo specifico di questa tossina nella patogenesi host.

Nei casi in cui la preparazione delle tossine purificate o altri fattori secreti è complesse o non è possibile, meccanismi perchiarire la funzione di questi prodotti sono stati tradizionalmente studiate attraverso la preparazione di surnatanti batterici filtrati, che vengono poi applicati alle cellule ospiti 18 – 20. Ci sono diverse sfide associate con questa tecnica. Innanzitutto, molti di questi fattori secreti, tra SLS, non mantengono la massima attività o coerenti quando immagazzinato e usato per ospitare le cellule in un secondo momento. Inoltre, quando supernatanti vengono raccolti in un unico punto di tempo e quindi applicati alle cellule ospiti, è difficile determinare rilevanza fisiologica e trarre conclusioni dirette sul processo di infezione naturale, in cui i fattori secreti si accumulano durante il corso di infezione per un concentrazione fisiologicamente rilevanti. Questa seconda sfida vale non solo per l'uso di surnatanti batteriche, ma anche per l'uso di tossine purificate studi su cellule host 1 – 3,8. Per affrontare questi problemi, un inse membrana permeabileSistema infezione rt-based è stato sviluppato per valutare gli effetti di SLS sulle cellule ospiti in un modo che mantiene l'attività ottimale tossine ed elimina anche la variabile di contatto diretto tra i batteri e cellule ospiti. In questo sistema, le cellule epiteliali umane sono coltivate in un monostrato nella camera inferiore di una camera di due ben e batteri vengono introdotti nella camera superiore del pozzo stesso. Una membrana porosa (0,4 micron pori) separa le camere superiori e inferiori, consentendo fattori secreti da scambiare tra le due camere, ma impedire il passaggio di batteri. Questo sistema ha permesso per una valutazione efficace delle risposte di accoglienza che sono esclusivamente a causa di componenti batterici secreti sostenuti eliminando tutte le risposte che si possono verificare attraverso il contatto diretto durante gruppo A infezione streptococcica. Sebbene altri fattori batterici secreti oltre SLS possono passare attraverso la membrana porosa, l'uso di un pannello mutante isogenico compresi wild-type (WT), un SLS-knockout (ΔsagA) e una saga ceppo complementato (ΔsagA + Saga) permette di valutare con precisione le risposte di accoglienza che sono strettamente dipendenti dalla SLS 21.

Anche se simili sistemi di inserti membrana permeabile sono stati impiegati per lo studio dei fattori secreti coinvolti nelle infezioni virali, biologia del cancro, e la migrazione delle cellule immunitarie 22 – 26, pochi studi che coinvolgono le interazioni batteriche con le cellule ospiti hanno utilizzato questo approccio 6,27,28. Anche gli studi che hanno utilizzato tali sistemi per esplorare le interazioni tra batteri e cellule ospiti sono principalmente concentrati sulla migrazione di cellule infiammatorie o batteri attraverso un monostrato epiteliale o endoteliale placcato sull'inserto membrana permeabile. Il sistema di infezione basato inserto membrana permeabile qui descritto è un metodo semplice ed efficace che si basa sulla separazione dei batteri e cellule ospiti tramite una membrana porosa per valutare l'effeCTS della tossina secreta, SLS, sulla integrità della membrana ospite, vitalità cellulare, la trasduzione del segnale cellulare, e fattori della cellula ospite secrete. Questa tecnica può essere adattato allo studio di altri fattori di virulenza secreti su una varietà di tipi di cellule di mammifero ospitante per studiare il ruolo di un fattore specifico batterica nel corso di una infezione.

Protocol

1. coltura batterica Generare ceppi mutanti isogeni da utilizzare per lo studio della specifica fattore secreto di interesse 21. Nota: I GASM1T1 5448 ceppi utilizzati per questi esperimenti inclusi WT GAS ', una saga Δ gatto SLS-carente mutante (abbreviato nel testo come Δ Saga), e una saga ceppo complementato (abbreviato nel testo come Δ Saga + Saga) 21. Preparare colture liquide durante la notte di ceppi batterici di interesse. Grow GAS M1T1 5448 ceppi a -10 ml di Todd-Hewitt brodo a 37 ° C per 16-20 ore prima di infettare cellule umane. Centrifuga colture batteriche durante la notte (2,400 RCF per 10 minuti) e risospendere in media batterica fresca. Nota: Resuspension nello stesso volume come le culture overnight sono state coltivate in (5-10 ml) generalmente produce un desiderabile densità ottica iniziale. Normalizzare colture batteriche aconcentrazioni iniziali uguali diluendo culture risospesi in mezzo batterica aggiuntiva fino alla stessa densità ottica a 600 nm (OD 600) è ottenuto per tutti i ceppi da testare (OD 600 di circa 1,0 è raccomandato per convenienza). Nota: In questi studi, colture batteriche fase stazionaria sono stati usati per infettare le cellule ospiti subito dopo la normalizzazione. Tuttavia, come alcuni ceppi di batteri uscita fase stazionaria nonsynchronously può essere più appropriato per iniziare infezioni host con culture fase log se questo è risultato essere il caso per i ceppi di interesse. Prima di ulteriori analisi, effettuare un conteggio delle colonie test per determinare le unità formanti colonie (CFU) per millilitro presente nelle colture di partenza in modo che la molteplicità di infezione (MOI), o il rapporto di batteri per cellula ospite, può essere determinato. Preparare 1 ml diluizioni seriali di colture batteriche che sono stati normalizzati al densi ottica desiderataty in tampone fosfato (PBS) o opportuno terreno di coltura batterica (Todd-Hewitt brodo è stato utilizzato in questi studi). Preparare diluizioni che vanno da 10 -1 a 10 -6 per produrre almeno un set di piastre di agar con colonie numerabili (30-300 colonie). Eseguire tutte le diluizioni in triplice copia. Trasferire 100 ml di ogni diluizione in serie su una piastra di agar contenente mezzo appropriato per le specie batteriche in fase di analisi. Nota: Todd-Hewitt agar è stato usato in questi studi. Utilizzare un bicchiere o spreader batterica plastica per distribuire uniformemente l'aliquota di 100 microlitri tutta la superficie della piastra di agar, e continuare a diffondere fino a quando il liquido è stato assorbito nel agar. Eseguire sotto fiamma con tecnica sterile. Incubare le piastre di agar a 37 ° C durante la notte o fino alla comparsa colonie numerabili. Contare le colonie che crescono su ciascuna piastra e calcolare i CFU / ml nella cultura originale dalla seguente formula: numero di colonie x inverso del volume di diluizione / culture seriale placcato in millilitri. es (200 colonie x 1/10 -5 diluizione) / 0,1 ml placcati = 2,0 x 10 8 UFC / ml 2. Host colture cellulari Ottenere una linea di cellula ospite appropriato per le analisi desiderati. Nota: HaCaT cheratinociti epiteliali umane 29, un gentile dono da V. Nizet, sono stati utilizzati per questi studi. Mantenere le cellule HaCaT in 100 piatti della cultura mm Modified Media Dulbecco di Eagle (DMEM) con il 10% di calore inattivato siero fetale bovino (FBS). Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. 3. Host cellulare L'infezione da permeabile membrana inserto Sistema cellule piastra in opportune piastre di coltura dei tessuti e permettere loro di crescere fino a raggiungere il 90% di confluenza. Nota: Le celle HaCaT utilizzati in questi studi generalmente raggiungano la confluenza entro 2-3 dAYS dopo la placcatura. Per la raccolta lisato (ad esempio analisi e dosaggi determinazione adenosina trifosfato (ATP) di segnalazione), piastra HaCaT in 6 piatti pozzetti alla densità di semina di circa 3 x 10 5 cellule / pozzetto. Per gli esperimenti di imaging di immunofluorescenza, le cellule piastra su vetrini sterili all'interno di 6 piatti e ad una densità di semina di circa 3 x 10 5 cellule / pozzetto. Per etidio omodimero permeabilizzazione della membrana e saggi di rilascio di lattato deidrogenasi (LDH), piastra HaCaT in 24 piatti e ad una densità di semina di circa 5 x 10 4 cellule / pozzetto. Immediatamente prima del trattamento, lavare le cellule con 1x PBS sterile. Applicare terreno di coltura fresco per le cellule. Per le condizioni qui descritte, applicare 2 ml di mezzo per pozzetto per 6 pozzetti o 0,5 ml di mezzo per pozzetto per 24 pozzetti. Se i trattamenti farmacologici sono in fase di sperimentazione, mescolare con terreno fresco e applicare durante questo step. Nota: alcuni saggi possono richiedere media alternativi. Ad esempio, il fenolo concentrazioni rosso e alta siero interferiscono con il test di rilascio di LDH, rosso fenolo privo DMEM integrato con 1% di albumina sierica bovina (BSA) (w / v), 2 mM L-glutammina e 1 mM di sodio piruvato era utilizzata per questi esperimenti. Dopo è stato applicato mezzo fresco, posizionare accuratamente sterile 0,4 micron inserto membrana permeabile in ciascun pozzetto. Eseguire questo passaggio in una cappa a flusso laminare, e utilizzare pinze sterili per trasferire l'inserto membrana permeabile in ogni pozzetto. Applicare fresco mezzo di coltura cellulare per la camera superiore di ogni pozzetto secondo le istruzioni del produttore. Per le condizioni qui descritte, applicare 1 ml di mezzo per pozzetto per 6 pozzetti o 0,1 ml di mezzo per pozzetto per 24 pozzetti. Applicare un volume adeguato di colture batteriche normalizzate (vedi paragrafo 1) alla camera superiore del sistema di inserimento membrana permeabile. Utilizzare media batterica per contr non infettotrattamenti olo. Per i risultati qui descritti, aggiungere 25 ml di culture normalizzati per camera per 24 pozzetti e aggiungere 100 ml di culture per camera per 6 pozzetti. Nota: In questi studi, wild-type o GAS mutante è stato applicato alle cellule ospiti ad una MOI di 10. MOI è stata calcolata in base al numero di cellule eucariote finali (ad esempio 2 x 10 6 cellule / pozzetto), tale che a 10 volte il numero di batteri sono stati aggiunti per cellula ospite all'inizio del periodo di infezione (ad esempio 2 x 10 7 CFU per bene). Appropriato MOI varierà con diverse specie batteriche e con le analisi di follow-up desiderati. Nota: Oltre a utilizzare media batterica per i controlli non infetti, altri controlli utili per certe applicazioni di questa tecnica possono includere batteri calore uccisi o medio batterica speso per il confronto. Incubare le cellule infettate a 37 ° C con 5% di CO 2. Collezione 4. Campione <ol> Per raccogliere mezzo di coltura cellulare, lisati cellulari host o vetrini con cellule intatte per il follow-up analisi, cominciare togliendo con cura l'inserto membrana permeabile con pinza sterile. Per la valutazione della protiens Host secreto: Raccogliere il mezzo dalla camera inferiore in provette da 1,5 ml. Evitare di disturbare il monostrato durante la raccolta. Centrifugare i campioni a 14.000 rcf per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Rimuovere tutti ma 50 ml di surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e conservare a -20 ° C o utilizzare immediatamente. Per la valutazione della Cell Host Lystates: Aspirare delicatamente il supporto sopra il monostrato di cellule ospiti. Evitare di disturbare il monostrato, in quanto ciò potrebbe comportare la perdita del campione. Lavare le cellule una volta con PBS 1x. Delicatamente aspirare PBS. Applicare immediatamente un volume adeguato di tampone di lisi ghiacciato per raggiungere la concentrazione proteina desiderata, e incubare lacampioni in ghiaccio per 15 min. Applicare tra 200 microlitri e 350 ml di tampone di lisi per pozzetto di ciascuna piastra 6 bene per ottenere concentrazioni proteiche tra 0,5 e 1,5 mg / ml. Nota: Il tampone di lisi utilizzato in questi studi era composta di acqua deionizzata, 1% (v / v) Nonidet P40 di riserva, un cocktail inibitore fosfatasi, e un cocktail di inibitori delle proteasi. reagenti specifici sono elencati nella sezione Materiali e attrezzature. Utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule dalla superficie della piastra di ogni pozzetto e pipettare l'intero contenuto di ciascun pozzetto in una provetta da 1,5 ml. Centrifugare i campioni a 14.000 rcf per 20 minuti a 4 ° C. Per valutare i componenti lisato solubili, rimuovere il surnatante in una nuova provetta e conservare a -20 ˚C o utilizzare immediatamente. Per valutare i componenti lisato insolubili nucleari o di altri, riservare il pellet e conservare a -20 ˚C o utilizzare immediatamente. Per la valutazione mediante immunofluorescenza Imaging: Comemedia dei pirati e lavare le cellule in 1x PBS freddo. Fix cellule durante la notte in% paraformaldeide (PFA) soluzione 4 in PBS (w / v). Nota: In questi studi, 1 ml di PFA è stato aggiunto per pozzetto di ogni 6 pozzetti. 5. Applicazioni suggerite Host Analisi di trasduzione del segnale mediante SDS-PAGE e Western Blotting Raccogliere lisati cellulari host come descritto nel paragrafo 4.3. Determinare la concentrazione di proteine ​​di ciascun lisato campione da acido bicinconinico (BCA) saggio o equivalenti utilizzando standard di proteine ​​30. Normalizzare concentrazioni di proteine ​​tra i campioni prima del caricamento e l'esecuzione dei campioni su un gel di poliacrilamide 4-15% o alternativa appropriata 31. Normalizza concentrazioni di campione pipettando la stessa quantità di proteine ​​di ogni campione (ad esempio 20 mg) in una nuova provetta da 1,5 ml e aggiungendo variabile volumi di tampone di lisi (polmone = volume totale – volume di campioneaggiunto) a ciascuna provetta per rendere il volume totale (esempio 50 microlitri) e finali equivalente concentrazione proteica di tutti i campioni. campioni di trasferimento in un fluoruro di polivinile (PVDF) membrana (o equivalente). Per i risultati descritti qui, campioni di trasferimento a 25 volts per 2 ore prima di aumentare la tensione a 70 volt per altri 45 min. Utilizzare buffer di trasferimento composto da 200 mm di base Tris, 1,5 M glicina e 20% di metanolo (v / v) in acqua deionizzata. membrane di blocco in 5% di BSA + 0,1% di Tween 20 in Tris Buffered Saline (TBS). Regolare pertanto basato su raccomandazioni del produttore per l'anticorpo da utilizzare. Incubare membrane con anticorpi primari notte a 4 ° C. Utilizzare al produttore raccomanda di diluizione. Lavare le membrane per 1,5 ore in TBS + 0,1% Tween 20; aggiornare tampone ogni 10-15 minuti. Incubare con perossidasi di rafano (HRP) coniugata anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 5000 per 1,5 ore a camera temperature. Lavare le membrane per 1,5 ore in TBS + 0,1% Tween 20; aggiornare tampone ogni 10 – 15 minuti. Incubare membrane con il reagente di rilevamento chemiluminescenza prima di sviluppare in un film in base alle istruzioni del produttore. Altri metodi di rilevamento possono essere utilizzati come desiderato. Cell Host immunofluorescenza colorazione e Imaging Fissare vetrini contenenti cellule ospiti, come descritto nel paragrafo 4.4. Rimuovere la soluzione PFA e lavare vetrini contenenti cellule trattate due volte in PBS, aspirare tra un lavaggio. Nota: PFA è altamente tossico e deve essere smaltito in modo appropriato. Bloccare le lamelle per 2 ore a temperatura ambiente in PBS con 1% (w / v) di siero normale di capra, 2% (v / v) Triton X-100, e 0,5% (v / v) Tween 20. Lavare coprioggetto con PBS per 30 minuti, rinfrescante il buffer ogni 10 min. Incubare i vetrini con anticorpo primario con un rapporto di 01:50 (o come raccomandato dal costruttore) nel bloccare solution notte a 4 ° C. Lavare i coprioggetti per 1,5 ore in PBS, rinfrescante il tampone ogni 30 min. Incubare i vetrini per 2 ore a temperatura ambiente in anticorpo secondario (capra anti-IgG di coniglio AlexaFluor488 stato usato per questi studi) con un rapporto 1: 200 di anticorpi soluzione bloccante. Lavare lamelle per 1 ora, rinfrescante il buffer ogni 20 min. Applicare macchie desiderati. Nota: Questi studi utilizzati DAPI (macchia nucleare) e rodamina-falloidina (actina macchia) con rapporti di 1: 1.000 in soluzione bloccante. Incubare coprioggetto con macchie nucleari e actina per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare coprioggetto in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, rinfrescante il tampone ogni 10 min. Montare i coprioggetti su vetrini con mezzo di montaggio. Consentire coprioggetto per impostare sulle diapositive durante la notte prima della sigillatura e di imaging. Per i risultati qui descritti, raccogliere le immagini su un microscopio a fluorescenza USIng un obiettivo standard di 20X. Utilizzare il software ImageJ e di imaging microscopio per elaborare le immagini catturate. Etidio omodimero Cell Death Assay Aspirare media da ciascun pozzetto e lavare le cellule due volte con PBS sterile. Applicare 4 mM etidio omodimero-1 in PBS. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Determinare il livello di fluorescenza utilizzando un lettore di piastre impostato a 528 nm di eccitazione e 617 nm di emissione con un valore di cut-off di 590 nm. Aggiungere 0,1% (w / v) saponina ciascun pozzetto dopo la lettura iniziale e lasciare che la piastra ad incubare per altri 20 minuti a temperatura ambiente (con dondolo) prima di leggere la piastra una seconda volta con le stesse impostazioni. Determinare cento permeabilizzazione della membrana singolarmente per ogni pozzetto dividendo la fluorescenza iniziale lettura (post-trattamento) dal secondo fluorescenza lettura (post-saponina). ATP Determinazione Assay <li> Raccogli lisati come descritto nel precedente paragrafo 4.3. Normalizzare i livelli di proteine ​​nei lisati tramite saggio BCA o simile 30. Determinare i livelli cellulari di ATP utilizzando un kit di determinazione ATP luminescenza-based o equivalente in base alle istruzioni del produttore. Normalizzare i valori trattati ai rispettivi campioni di controllo non infetti. LDH saggio di rilascio Dopo l'infezione, raccogliere surnatanti come descritto nel paragrafo 4.3. Valutare il rilascio di LDH utilizzando un kit di rilevamento citotossicità per il rilascio di LDH secondo le istruzioni del produttore.

Representative Results

L'inserto basato protocollo di sistema infezione membrana permeabile sviluppato per lo studio dei fattori batterici secreti è dettagliato in figura 1. Questo sistema si basa sulla separazione dei batteri e cellule ospiti tramite una membrana porosa per valutare gli effetti di fattori batterici secreti, in questo caso Streptolisina S (SLS), sulle risposte di accoglienza come l'integrità dell'host membrana, vitalità cellulare, la trasduzione del segnale cellulare, e fattori cellula ospite secreti. la Figura 2 fornisce dati rappresentativi Western Blot che dimostrano che questo sistema può essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella attivazione di contatto segnalazione di accoglienza proteine ​​-indipendenti. In particolare, i dati rappresentativi mostrano significativamente migliorati attivazione p38 MAPK in presenza di ceppi GAS SLS producono. Questo sistema può essere applicato anche per visualizzare gli effetti di fattori batterici secreti sulla localizzazione proteina ospite di immunofluorescenza (<strong> Figura 3). I dati mostrano attivazione SLS-dipendenti del mediatore infiammatorio chiave Nuclear Factor kappa B (NFκB), che trasloca dal citoplasma al nucleo al momento dell'attivazione 21. I risultati in figure 2 e 3 indicano che sia SLS-dipendente risposte infiammatorie segnalazione non richiedono il contatto diretto tra i batteri e cellule ospiti. Come esperimenti precedenti hanno già dimostrato SLS-dipendente p38 e l'attivazione NFκB in modelli di infezione diretti 21, simili livelli di p38 o l'attivazione NFκB tra i tre ceppi di gas nel sistema di inserimento a base di membrana permeabile avrebbero indicato che la risposta necessaria contatto diretto tra il batteri e cellule ospiti. Figura 4 dimostra che questo sistema infezione può essere applicato per valutare i cambiamenti tossina-dipendenti citotossicità host tramite saggi di etidio omodimero e rilascio di LDH. Ciò è dimostrato dal significativo incremento in sia permeabilizzazione della membrana e nel rilascio di LDH da cellule ospiti esposte a ceppi gas contenente SLS rispetto alle cellule non infette o cellule esposte al ceppo SLS-carenti. Questi cambiamenti nella citotossicità non sono immediati, come effetti significativi non sono evidenti fino dall'infezione 12 ore nel caso di permeabilizzazione della membrana e 16 ore nel caso di rilascio di LDH. I dati rappresentativi illustrano l'importanza di selezionare adeguati punti di tempo e le condizioni di infezione per la valutazione di queste risposte di accoglienza. Oltre a consentire per la valutazione di accoglienza segnalazione cambiamenti e citotossicità, il sistema di infezione inserto basato membrana permeabile è applicabile allo studio delle variazioni metaboliche come accurata determinazione dei livelli di ATP ospitante impedendo la contaminazione batterica dei lisati cellulari host (figura 5) . Questi dati mostrano una significativa perdita di cheratinociti ATP in risposta alle infezioni GAS da 16 ore dopo l'infezione, con una maggiore perdita di ATP in la presenza di SLS. Questi risultati sono coerenti con le osservati incrementi tossina-dipendente in Host segnalazione dello stress-risposta e la citotossicità. Figura 1: Schema di infezione permeabile membrana Insert-Based System Protocol per valutare gli effetti di fattori batterici secreti su cellule ospiti cheratinociti umani sono placcati nel vano inferiore e cresciuto al 90% di confluenza.. Una membrana rivestita di collagene con 0,4 micron pori separa le camere superiori e inferiori, e batteri vengono aggiunti alla camera superiore del sistema di inserto membrana permeabile per il periodo di infezione desiderato. Surnatanti coltura cellulare e le cellule ospiti possono essere raccolte dopo il periodo di infezione e utilizzati per una serie di analisi. Clicca qui per vedere una versione più grandedi questa figura. Figura 2:. Il sistema di infezione permeabile membrana Insert-based può essere utilizzato per Cell Host lisato analisi mediante SDS-PAGE e Western Blotting I dati rappresentativi dimostrano che la SLS aumenta l'attivazione della via p38 MAPK nei cheratinociti infetti. (A) HaCaTs sono stati infettati con il gas per 7 ore tramite il sistema di infezione inserto membrana permeabile (al MOI = 10) e lisati sono stati valutati per l'attivazione di p38. (B) Densitometria da tre macchie indipendente occidentale è stata effettuata per quantificare la relativa attivazione di p38 in risposta a GAS'infection. Medie da tre repliche biologiche sono indicati, con barre di errore rappresentano la deviazione standard. relativa attivazione di p38 è rappresentato come livello di proteina fosforilata / totale. La significatività statistica è stata determinata rispetto alcellule non infettate. Il p-valore complessivo è stato determinato ANOVA (p = 0,0063). test di Dunnett sono stati eseguiti post hoc per confrontare ogni condizione al corrispondente di controllo non infetto significare. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Questa cifra è stata modificata da Flaherty et al. 2015 21. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3:. Il sistema di infezione permeabile membrana Insert-Based permette la visualizzazione di Host segnalazione modifiche mediante immunofluorescenza Microscopia I dati rappresentativi mostrano che Streptolisina S aumenta di segnalazione pro-infiammatorie attraverso l'attivazione di NFκB. HaCaT cheratinociti umani sono stati infettati con il gas a una M OI 10 per 8 ore utilizzando il sistema di infezione basato inserto membrana permeabile. (A e B) la localizzazione nucleare di NFκB stata valutata mediante imaging immunofluorescenza. La percentuale di cellule localizzate nucleari stato calcolato contando il numero di cellule in cui NFκB aveva traslocati dal citoplasma al nucleo per un dato campo e dividendo questo numero per il numero totale di cellule per lo stesso campo. Barre di scala indicano 100 micron. (A) La media di tre repliche biologiche sono rappresentate per ogni condizione con barre di errore rappresentano la deviazione standard. Il p-valore complessivo è stato determinato ANOVA; p <0,0001. test di Dunnett sono stati eseguiti per confrontare ogni condizione alla condizione di controllo non infetto corrispondente. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Questa cifra è stata modificata da Flaherty et al. 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4:. Il Sistema di infezione permeabile membrana Insert-Based consente la determinazione di batterica-Mediated membrana Permeabilization e citotossicità in assenza del diretto contatto tra i batteri e le cellule ospiti I dati rappresentativi dimostrano che cheratinociti vitalità diminuisce in presenza di attiva tossina SLS . GAS – indotta morte cellulare è stata valutata in HaCaT in presenza di WT, SLS-carente o SAGA GAS complementato cheratinociti sono stati esposti a GAS utilizzando il sistema di infezione inserto basato membrana permeabile per 8-16 ore ad una MOI di 10. (. A) La vitalità è stata valutata mediante test di etidio omodimero o saggio di rilascio B) LDH (. In entrambi i pannelli, 3 REplicates viene calcolata la media e le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Significato per ogni punto di tempo è stata determinata mediante ANOVA (A) 8 ore, p = 0,0241; 12 ore, p <0,0001 (B) 8 ore, p = 0,0287; 12 hr, p = 0,1977; 16 ore, p = 0,0031. test di Dunnett sono stati eseguiti per confrontare le medie da ciascuna condizione all'infezione wild-type per il punto di tempo corrispondente. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Questa cifra è stata modificata da Flaherty et al. 2015 21. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5: Il sistema di infezione permeabile membrana Insert-based consente per la determinazione accurata dei livelli di ATP Host impedendo Bacterial contaminazione di Cell Host lisati. I dati rappresentativi dimostrano SLS dipendenti dalla perdita di ATP durante gruppo A infezione streptococcica. HaCaT sono state infettate con gas per 8-16 ore usando il sistema di infezione a base di inserto membrana permeabile. Repliche tecniche (n = 3) da un replicato biologica rappresentante (2 x 10 6 cellule per campione) sono stati mediati per ogni condizione, con barre di errore rappresentano la deviazione standard. Il P-valori complessivi sono stati determinati da ANOVA (12 ore, p <0,0001; 16 ore, p <0,0001). test di Dunnett sono state effettuate per confrontare ogni condizione con l'infezione da wild-type per il punto di tempo corrispondente. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Questa cifra è stata modificata da Flaherty et al. 2015 21. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui viene descritto un metodo che utilizza un sistema di un'infezione inserto basato membrana permeabile per esaminare gli effetti della tossina batterica Streptolisina S sui cheratinociti epiteliali umane in un sistema in vitro. Questo protocollo può essere adattato per lo studio di altri fattori di virulenza batterici secreti e tipi di cellule ospite alternativi. Questo sistema recentemente sviluppato offre diversi vantaggi rispetto ai metodi sperimentali che utilizzano le tossine purificate o surnatanti batterici filtrati 1 – 3,8,18 – 20. Il sistema basato inserto membrana permeabile fornisce una dose mantenuta costantemente della tossina batterica pertinenti alle cellule ospiti come viene prodotto, che consente l'attività di tossina massima da mantenere e aumenta anche la coerenza tra esperimenti. Inoltre, questo sistema imita più da vicino le condizioni fisiologiche, consentendo il fattore secreto di accumulare nel tempo l'infezione progredisce e eliminari la necessità di selezionare arbitrariamente concentrazioni di tossine specifiche da applicare alle cellule ospiti. Inoltre, questo sistema fornirebbe inoltre mezzi per gli investigatori per valutare se un fattore batterica di interesse viene trasportato al cellule ospiti in maniera contatto-dipendente. Contatto-dipendenza è spesso testato attraverso la generazione di mutanti batterici isogenici carenti di aderenza o attraverso l'uso di reagenti che impediscono l'aderenza. Il sistema qui descritto fornirebbe una semplice alternativa per integrare o sostituire questi approcci tradizionali.

Oltre alle applicazioni testate descritti nella sezione 5 del protocollo, altre applicazioni per cui questo sistema l'infezione potrebbe essere facilmente adattato comprendono la raccolta di campioni per gli array di citochine e saggi ELISA. In entrambi i casi, un protocollo simile a quello descritto per saggi di rilascio LDH può essere seguita. Sebbene non illustrato, questo sistema è stato utilizzato per raccogliere efficacemente campioni cellula ospite per essere unnalyzed mediante citometria di flusso. In questa applicazione, l'inserto membrana permeabile viene rimosso dopo il periodo di infezione, le cellule vengono lavate per rimuovere mezzo di coltura cellulare, e tripsina viene applicato per consentire la raccolta delle cellule per l'analisi. La separazione fisica dei batteri da cellule ospiti è particolarmente utile per questa applicazione perché aiuta a prevenire la formazione di grandi aggregati compresi batteri aderito e cellule ospiti che altrimenti potrebbero interferire con il conteggio delle cellule accurata dal citofluorimetro.

Sebbene risposta dell'ospite molto consistenti sono stati osservati quando si confrontano i risultati degli studi infezione inserto basato membrana permeabile con studi infezione diretti tradizionali, alcune differenze notevoli nella cinetica di queste risposte dell'ospite sono stati osservati 21. Per esempio, cambiamenti nella segnalazione host e membrane a base di citotossicità prendono 30-50% più a verificarsi nel modello di infezione inserto basato membrana permeabile che corrispondendo modelli di infezione diretti. Poiché il sistema di inserimento basato membrana permeabile richiede supporto da applicare ai compartimenti superiore e inferiore di ogni pozzetto, il sistema sviluppato per gli studi descritti qui richiesto un aumento del 30% in volume medio totale per pozzetto rispetto ai corrispondenti modelli di infezione diretti utilizzati in precedenza 21. Questa differenza di volume medio totale, accoppiato con l'aumento della distanza tra i batteri e cellule ospiti quando è vietato contatto diretto, probabilmente aumenta il tempo necessario per SLS diffondere attraverso il mezzo per raggiungere cellule ospiti e suscitare gli effetti osservati. Inoltre, il sistema basato su inserto membrana permeabile rimuove molti fattori di virulenza GAS che possono contribuire a ospitare i danni delle cellule; l'assenza di questi fattori aggiuntivi di questo sistema è anche in grado di contribuire al ritardo nella morte della cellula ospite e l'avvio di eventi di segnalazione di accoglienza rispetto al contagio diretto 21. Questi fattori devono essere consideratidurante la progettazione di esperimenti per valutare gli altri componenti batteriche secrete.

Per identificare le condizioni più significativi per testare gli effetti di fattori batterici secreti in cellule ospiti, testare una serie di punti di tempo per ogni applicazione del sistema dell'infezione inserto basato membrana permeabile è raccomandato. È importante considerare in quali condizioni il fattore di virulenza di interesse specifico è ottimale prodotti (per esempio fase log, fase stazionaria, in risposta a certi segnali ambientali, etc.) al fine di osservare con successo i suoi effetti. In esperimenti focalizzati sulla valutazione cambiamenti nelle proteine ​​di segnalazione di accoglienza, è stato necessario selezionare i punti temporali che hanno permesso un tempo adeguato per SLS per raggiungere le cellule ospiti e ad essere prodotto in quantità sufficienti per indurre la segnalazione cambia 21. Allo stesso tempo, la valutazione delle variazioni ospitante segnalazione doveva essere condotto prima permeabilizzazione della membrana SLS indotta, come questo effetto complicates la raccolta dei lisati cellulari di accoglienza per l'analisi. La morte cellulare indotta da SLS potrebbe essere ottimale osservato in entrambi i modelli di infezione inserto a base di membrana diretta e permeabile diverse ore dopo l'inizio degli eventi di segnalazione segnalati 21. Inoltre, nella selezione punti di tempo di interesse, è anche importante garantire che i batteri in fase di studio sono in grado di penetrare la membrana porosa inserto durante il periodo di studio. La produzione di alcuni componenti batterici per un periodo prolungato può compromettere l'integrità della membrana e permettere il passaggio di batteri al vano inferiore. Per determinare se questo è un problema potenziale nel sistema di interesse, i ceppi batterici da studiare possono essere applicati alla camera superiore del sistema basato inserto membrana permeabile ad una serie di punti temporali. Ad ogni punto di tempo, l'inserto può essere accuratamente rimosso e il mezzo dalla camera inferiore può essere raccolto e utilizzato in una colonia co normalesaggio unting (vedi paragrafo 1.5). Se nessuna colonia sono formate dal mezzo di coltura cellulare nel vano inferiore, la membrana inserto può essere assunta da impedire efficacemente il passaggio di batteri al punto di tempo e carica batterica testato.

Un altro componente disegno sperimentale che è probabile che richiedono ottimizzazione per l'analisi efficace dei fattori batterici secreti è la molteplicità di infezione (MOI). La MOI si riferisce al rapporto di cellule batteriche per cellula ospite, ed è quindi influenzata dalla confluenza cellula ospite al momento dell'infezione e per il numero di unità formanti colonie batteriche (CFU) applicato alle celle. In questi studi, le cellule cheratinociti sono state coltivate al 90% di confluenza, che ha permesso queste cellule a formare un monostrato coeso con giunzioni strette intatti. Riflessivo considerazione dell'organizzazione fisiologica delle cellule ospiti da studiare è necessario selezionare una confluenza appropriato per esperimenti di infezione. Una volta che un appropril numero iate delle cellule ospiti per pozzetto è determinato, un CFU batterica adatta può essere calcolato in base al largo della MOI desiderato. Negli studi qui descritte, GAS è stato applicato per ospitare cellule ad una MOI di 10. appropriato MOI varierà con batteri diversi e con le analisi di follow-up desiderati. Un basso dall'inizio MOI è in genere più fisiologicamente rilevanti e permette per il fattore di batteri di interesse di accumulare abbastanza lentamente per cogliere sottili cambiamenti nella segnalazione della cellula ospite prima di cambiamenti drammatici nella vitalità della cellula ospite sono evidenti. MOI superiori sono utilizzati in molti studi di valutazione citotossicità, ma questo effetto può essere ottenuta anche iniziando con un basso MOI e permettendo l'infezione di progredire per un periodo di tempo più lungo. È importante determinare un accurato CFU per corollario densità ottica per tutti i ceppi batterici da testare, come mutanti isogeni possono avere un tasso di crescita alterata rispetto ai batteri wild-type e può quindi richiedere che un CFU superiore o inferiore è aggiunto per pozzetto pergarantire un opportuno confronto della risposta dell'ospite tra i ceppi. Nei casi in cui le cellule ospiti di mammifero in fase di studio sono in grado di uccidere batteri o inibire la crescita o se si sospetta la crescita nonsynchronous tra ceppi batterici, può anche essere utile effettuare studi per valutare la carica batterica finale al termine del periodo di infezione. Ciò potrebbe essere realizzato raccogliendo il contenuto dell'inserto permeabile ed eseguendo un test conteggio delle colonie simile a quella descritta nella sezione 1.5 della procedura.

Selezione pozzi opportunamente dimensionati per il dosaggio desiderato è anche importante per ottenere risultati ottimali. inserti membrana permeabile sono disponibili in una varietà di formati, ma i risultati più consistenti per gli studi qui riportati sono stati osservati con inserti progettati per il 24 e ben 6 piastre di coltura dei tessuti e. Queste dimensioni inserto sono relativamente facili da maneggiare con pinza sterile, e la facilità di manipolazione è fondamentale nel prevenireing trasferimento indesiderato di batteri dal vano superiore al vano inferiore del pozzo. Per gli esperimenti che coinvolgono la raccolta dei lisati cellulari ospitanti, 6 piatti e forniscono un numero di cellulare adeguato per condizione per la maggior parte delle analisi e sono grandi abbastanza per ospitare raschietti cellulari per la raccolta dei campioni. Per i saggi di citotossicità in cui le cellule ospiti rimangono aderenti e sono etichettati con un fluorescenti o tintura colometriche che può essere misurata in un lettore di piastre (ad esempio etidio saggio omodimero, trypan saggio di esclusione blu), l'uso di una piastra ben 24 con gli inserti corrispondenti è consigliato. Per gli esperimenti in cui mezzo di coltura cellulare verrà raccolto e analizzato (ad esempio il rilascio di LDH, studi citochine) il 24 bene o 6 piatti e possono essere utilizzati, anche se i pozzi più piccoli in genere forniscono adeguati volumi di campione per queste analisi e ridurre al minimo l'uso della richiesta reagenti. Nel complesso, il metodo è molto versatile e può essere adattato a seconda delle necessità per preparare samples per numerose applicazioni di follow-up.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.

Materials

Todd-Hewitt broth Acumedia 7161A Use appropriate broth for bacterial species of interest.
BioSpectrometer Eppendorf basic model Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. 
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713 Other brands are suitable.
Agar Sigma A1296-1kg Other brands are suitable.
HaCaT human epithelial keratinocytes Gift from lab of Victor Nizet.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11995-073 Use appropriate media for cell line of interest.
Fetal Bovine Serum (FBS) Biowest S162H Use appropriate media additives for cell line of interest.
10cm tissue culture dishes Nunc 150350 Other brands are suitable.
6 well tissue culture dishes CytoOne cc7682-7506 Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
24 well tissue culture dishes CytoOne cc7682-7524 Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
Glass coverslips Fisherbrand 12-541-B These must be autoclaved prior to use for cell plating.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 10010-023
Phenol Red Free DMEM Life Technologies 31053028 Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
L-glutamine Gibco 25030149 Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Sodium pyruvate Gibco BP356100 Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) Corning 3540
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) Corning 3595
Forceps Fisher 3120018 These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts.
Cell scrapers Fisherbrand 08-100-241 These are only required for the collection of cell lysates.
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500 TOXIC.  This is only required for immunofluorescence imaging.
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit Pierce 23227 Other protein quantification assays may be used.
Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels BioRad 4561083 Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest.
Electrophoresis cassette supplies BioRad 1658063 Only required for Western Blotting.
Electrophoresis power supply BioRad 1645050 Only required for Western Blotting.
Western blot transfer cassette BioRad Only required for Western Blotting.
Polyvinylidene (PVDF) Membrane EMD Millipore IPVH00010 Only required for Western Blotting.
Tween 20 Sigma P1379-500mL
Rabbit IgG-HRP secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc2030 The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
Mouse IgG-HRP secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc2031 The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody Cell Signaling 4511 Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Total p38 MAPK antibody Cell Signaling 8690 Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 Molecular Probes A-11034 Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection.
LumiGLO Detection Reagent KPL 54-61-00 Only required for Western Blotting with detection on film.
Detection film Biodot BDB57 Only required for Western Blotting with detection on film.
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope Nikon Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses.
Normal goat serum Thermo Scientific 31873
Triton X-100 Sigma T9284-500mL
DAPI nuclear stain Cell Signaling 4083 Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Rhodamine-phalloidin actin stain Molecular Probes R415 Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Only required for immunofluorescence imaging.
Ethidium homodimer 1 Molecular Probes E1169 Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Spectramax M5 Microplate Reader Molecular Devices Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable.
Saponin Sigma 47036-50G-F Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Molecular Probes ATP Determination Kit Life Technologies A22066 Other kits are likely to be suitable.
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release Roche 11644793001 Other kits are likely to be suitable.
Nonidet P40 Substitute Sigma 74385-1L Other suppliers are suitable.
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78420B Other cocktails are likely to be suitable.
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free Sigma S8830-2TAB Other cocktails are likely to be suitable.
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Flaherty, R. A., Lee, S. W. Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells. J. Vis. Exp. (114), e54406, doi:10.3791/54406 (2016).
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