JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie und Infektion

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

Published: August 19, 2016
doi:
10.3791/54406
,
1Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health,University of Notre Dame

Summary

כאן, שיטה באמצעות מערכת זיהום קרום חדירה מבוסס כנס כדי לחקור את ההשפעות של Streptolysin S, רעלן מופרש המיוצר על ידי הקבוצה סטרפטוקוקוס, על קרטינוציטים מתוארת. מערכת זו יכולה בקלות להיות מיושמת בחקר חלבונים חיידקיים מופרשים אחרים על סוגי תא מארח שונים במהלך הדבקה.

Abstract

חיידקים פתוגנים רב מפרישים רעלנים חזקים כדי לסייע וההרס של רקמות מארחות, ליזום שינויי איתות תאי מארח או לתמרן תגובות מערכת חיסוניות במהלך הזיהום. למרות שיטות פותחו כדי לטהר בהצלחה ולהפיק רבים של גורמים הארסיים החשובים אלה, יש עדיין הרבה רעלנים חיידקיים שמבנה ייחודי או שלאחר translational שינויים נרחבים לגרום להם קשה לטהר וללמוד במערכות במבחנה. יתר על כן, גם כאשר הרעלן טהור ניתן להשיג, ישנם אתגרים רבים הקשורים ללימוד ההשפעות הספציפיות של רעלן בתנאים פיסיולוגיים רלוונטיים. רוב במודלי תרבית תאים במבחנה נועדו להעריך את ההשפעות של רעלנים חיידקיים מופרשים בתא פונדקאי לערב דוגרי תאי מארחים עם מנה חד-פעמית של הרעלן. שיטות כאלה גרועים משוערים מה תאים מארחים למעשה ניסיון במהלך זיהום, שם רעלן מיוצר ללא הרף על ידיתאים חיידקיים ניתן לצבור בהדרגה במהלך זיהום. פרוטוקול זה מתאר את העיצוב של קרום חדיר להכניס מערכת מבוססת זיהום חיידקים כדי לחקור את ההשפעות של Streptolysin S, רעלן חזק היוצר על ידי הקבוצה סטרפטוקוקוס, על קרטינוציטים אפיתל אנושיים. מערכת זו הדוקה יותר המחקה את הסביבה הפיזיולוגית הטבעית במהלך זיהום מאשר שיטות שבו הרעלן טהור או supernatants חיידקי מוחלים ישירות לארח תאים. חשוב לציין, שיטה זו מבטלת גם את ההטיה של תגובות מארחות כי הן בשל לכוון קשר בין החיידקים ותאי מארח. מערכת זו נוצלה כדי להעריך את ההשפעות ביעילות של Streptolysin S (SLS) על שלמות קרום מארח, כדאיות הסלולר, ותגובות איתות הסלולר. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מיושמת המחקר של גורמים ארסיים מופרשים אחרים על מגוון של סוגי תאי מארח יונקים לחקור את התפקיד הספציפי של ד גורם חיידקי מופרשuring במהלך זיהום.

Introduction

הבנת הפונקציה של גורמים ארסיים חיידקים בהקשר של תא זיהום המארח היא מוקד עיקרי של מחקר בפתוגנזה חיידקים. חיידקים פתוגנים רב פעיל להפריש רעלים וגורמים מסיסים אחרים כדי לסייע וההרס של רקמות מארחות, ליזום שינויי איתות תאי מארח או לתמרן תגובות מערכת חיסוניות במהלך הזיהום 1 – 10. למרות שיטות פותחו כדי לטהר בהצלחה ולהפיק רבים של הגורמים ארסי החשובים האלה למחקר, מוצרי חיידקים כמה יש מבנים ייחודיים או שלאחר translational שינויים נרחבים שהופכים אותם למועמדים סרבנים לשיטות טיהור ועל כן אינו יכול להילמד בבידוד באמצעות במערכות חוץ גופייה . לדוגמא, קבוצת A Streptococcus, הפתוגן חיידקי אחראי המספר עצום של זיהומים החל דלקת לוע אל fasciitis necrotizing לתסמונת הלם רעיל, מייצר מופרשרעלן חיידקים המכונה Streptolysin S (SLS) 11 – 17 שנים. פפטיד ribosomally המיוצר זה מקודד על ידי הגן קשור Streptolysin S (SAG) האשכול, ואת המוצר הבוגר מוערך 2.7 kDa בגודל 14 – 17. Protoxin, המקודד על ידי Saga, משתנה שלאחר translationally ידי אנזימים שונים (SagB, SagC, ו SagD) לייצר בצורה הבוגרת, פונקציונלית 15 – 17 שנים. המורכבות של שינויים אלה שלאחר translational בשילוב עם רצף החומצות האמיניות חריג של הרעלן הפכו את הרעלן עולה בקנה אחד עם כל המאמצים הבהרה טיהור ומבנה כבר ניסו לצאת 15,17. יש אתגרים אלה המאמצים מסובכים לקבוע את התפקיד הספציפי של רעלן זה בפתוגנזה מארח.

במקרים שבהם הכינו רעלים מטוהרים או גורמים מופרשים אחרים הוא או מורכב או לא אפשרי, מנגנוניםלהבהיר את הפונקציה של מוצרים אלה נחקרה באופן מסורתי תוך הכנת supernatants חיידקים המסונן, אשר חלים מכן לארח תאים 18 – 20. ישנם מספר אתגרים הקשורים הטכניקה הזו. ראשית, רב גורמים המופרשים אלה, כולל SLS, לא לשמור פעילות מקסימלי או עקבית כאשר הם מאוחסנים ויישומים לארח תאים במועד מאוחר יותר. בנוסף, כאשר supernatants נאסף בנקודת זמן אחת ולאחר מכן להחיל לארח תאים, קשה לקבוע את הרלוונטיות פיסיולוגיות להסיק מסקנות ישירות לגבי תהליך ההדבקה הטבעי, שבו גורמים מופרשים מותר לצבור במהלך זיהום על ריכוז רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אתגר שני זה חל לא רק על השימוש של supernatants בקטריאלי, אלא גם את השימוש של רעלים מטוהרים במחקרי תא מארח 1 – 3,8. כדי לטפל בבעיות אלה, inse קרום חדירRT מערכת מבוססת זיהום פותחה כדי להעריך את ההשפעות של SLS בתא פונדקאי בצורה מקיימת פעילות הרעלן אופטימלית וגם מבטלת את המשתנה של מגע ישיר בין חיידקים ותאי מארח. במערכת זו, תאי אפיתל אדם גדלים בשכבה בתא התחתון של תא שני היטב, וחיידקים מוכנסים לתא העליון של אותו היטב. קרום נקבובי (0.4 מיקרומטר נקבוביים) מפריד בין תאים העליונים ותחתונים, המאפשר גורמים מופרשים שיוחלפו בין שני התאים אבל מניעת המעבר של חיידקים. מערכת זו אפשרה הערכה אפקטיבית של תגובות מארחות שהם אך ורק בשל רכיבי חיידקי מופרש מתמשכים תוך ביטול כל תגובות שעלולות להתרחש באמצעות מגע ישיר במהלך סטרפטוקוקלית זיהום קבוצת א '. למרות גורמים חיידקיים המופרשים אחרים מלבד SLS גם יכול לעבור דרך הממברנה נקבובי, השימוש של פנל מוטציה isogenic כולל wild-type (WT), גידול SLS-KNockout (ΔsagA) ו זן השלים סגה (Saga + ΔsagA) מאפשר הערכה מדויקת של תגובות מארחות כי הם בהחלט SLS התלוי 21.

בעוד שמערכות להוסיף קרום חדירים דומות הועסקו לחקר גורמים המופרשים מעורבים זיהומים נגיפיים, ביולוגית סרטן, נדידת תאי חיסון 22 – 26, מספר מחקרים שכללו אינטראקציות חיידקים עם תאי מארח השתמש בגישה זו 6,27,28. גם מחקרים אשר העסיקו מערכות כאלה כדי לחקור אינטראקציות בין חיידקים ותאים מארח התמקדו בעיקר על הגירה של תאים דלקתיים או חיידקים דרך monolayer אפיתל או האנדותל מצופה על להכניס קרום חדיר. הקרום החדיר מערכת זיהום כנס המבוססת המתוארים כאן היא שיטה פשוטה ויעילה אשר מסתמכת על הפרדת חיידקים ותאים מארחים באמצעות קרום נקבובי להעריך את effeCTS של הרעלן המופרש, SLS, על שלמות קרום מארח, כדאיות הסלולר, הולכים אותות סלולריים, וגרם תא מארח מופרשים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת ללימוד גורמים ארסיים מופרשים אחרים על מגוון של סוגי תאי מארח יונקים לחקור את התפקיד של גורם חיידקים ספציפי במהלך דלקת.

Protocol

1. תרבית חיידקים צורו זנים מוטנטים isogenic לשמש לחקר הגורם המופרש הספציפי של עניין 21. הערה: זני GASM1T1 5448 מנוצלים עבור ניסויים אלו כללו WT גז ', חתול Δ הסאגה SLS מחסר מוטציה (מקוצר בטקסט כמו הסאגה Δ), ו זן השלים סאגה (מקוצר בטקסט כמו Δ סאגה + סאגה) 21. הכן תרבויות נוזלי לילה של זני חיידקים עניין. לגדול GAS M1T1 5448 זנים -10 מ"ל של מרק טוד יואיט ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-20 שעות לפני הדבקה של תאים אנושיים. צנטריפוגה לילה תרביות חיידקים (2,400 RCF במשך 10 דק ') ו resuspend במדיום חיידקים טרי. הערה: Resuspension באותו נפח כמו תרבויות לילה גדלו (5-10 מ"ל) בדרך כלל יוצר צפיפות אופטית הראשונית רצוי. לנרמל תרבויות חיידקיםריכוזי זינוק שווים על ידי דילול התרבויות מחדש מושעה במדיום חיידקים נוסף עד אותו הצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) מתקבלים עבור כל הזנים להיבדק (OD 600 של כ 1.0 מומלץ מטעמי נוחות). הערה: במחקרים אלה, תרביות חיידקים בשלב נייח שמשו להדביק תאי מארח מייד לאחר נורמליזציה. עם זאת, כמו כמה זנים של הפאזה יציאת חיידקי nonsynchronously זה עשוי להיות מתאים יותר להתחיל זיהומים מארחים עם תרבויות בשלב יומן אם זה יימצא במקרה של הזנים של עניין. לפני ניתוח נוסף, לבצע מושבה לספור assay כדי לקבוע את יחידות המושבה להרכיב (CFU) לכל נוכחי למיליליטר בתרבויות החל כך הריבוי של זיהום (משרד הפנים), או היחס של חיידקים לכל תא מארח, ניתן לקבוע. הכן 1 מ"ל דילולים סדרתי של תרביות חיידקים כי כבר מנורמל ל Densi האופטי הרצויty ב בופר פוספט (PBS) או בינוני התפתחות חיידקים המתאים (מרק טוד יואיט שימש במחקרים אלה). כן דילולים הנעים בין 10 -1 עד 10 -6 לייצר לפחות קבוצה אחת של צלחות אגרו עם מושבות ספיר (30-300 מושבות). בצע את כל הדילולים בשלושה עותקים. העברת 100 μl של כל דילול סדרתי לצלחת אגר המכיל בינוני מתאים מינים של חיידקים להיות מנותח. הערה: אגר טוד יואיט שימש במחקרים אלה. בעזרת כוס או מפזר חיידקי פלסטיק כדי לפזר את aliquot 100 μl באופן שווה על פני כל פני השטח של צלחת אגר, ולהמשיך להפיץ עד שהנוזלים נספגו לתוך אגר. בצע תחת אש באמצעות טכניקה סטרילית. דגירת הצלחות אגרו על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה או עד מופיעות מושבות ספיר. ספירת המושבות הגדלות על כל צלחת ולחשב את המ"ל / CFU בתרבות המקורית ידי formu הבאלה: מספר מושבות x ההופכי של נפח דילול / תרבות סדרתי מצופה מיליליטרים. למשל (200 מושבות x 1/10 -5 דילול) / 0.1 מ"ל מצופה = 2.0 x 10 8 CFU / ml 2. מארח תרבית תאים לקבלת קו תא המארח מתאים עבור הניתוחים הרצויים. הערה: קרטינוציטים אדם HaCaT אפיתל 29, מתנה סוג מ V. Nizet, שימשו במחקרים אלה. שמור על תאי HaCaT ב 100 מנות תרבות מ"מ הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי חום מומת (FBS). לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. 3. מארח זיהום נייד עם מערכת הכנס קרום חדיר פלייט תאים בצלחות בתרבית רקמה המתאימה ולאפשר להם לגדול עד שהם מגיעים 90% confluency. הערה: תאי HaCaT שימוש במחקרים אלה בדרך כלל להגיע confluency תוך 2-3 דays לאחר ציפוי. לקבלת אוסף lysate (למשל איתות ניתוח אדנוזין אדנוזין (מבחני נחישות ATP)), צלחת תאים HaCaT ב 6 מנות גם בצפיפות זריעה של כ 3 x 10 5 תאים / היטב. בניסויים הדמיה immunofluorescence, תאים צלחת על coverslips זכוכית סטרילית בתוך 6 מנות גם בצפיפות זריעה של כ 3 x 10 5 תאים / היטב. עבור permeabilization קרום homodimer ethidium ו לקטט דהידרוגנאז (LDH) מבחני שחרור, צלחת תאים HaCaT ב 24 מנות גם בצפיפות זריעה של כ 5 x 10 4 תאים / היטב. מיד לפני הטיפול, לשטוף תאים עם PBS 1x סטרילי. החל מדיום גידול טרי לתאים. לקבלת בתנאים המתוארים כאן, להחיל 2 בינוני מ"ל לכל טוב במשך 6 צלחות היטב או 0.5 מ"ל בינוני לכל טוב במשך 24 צלחות היטב. אם נבדקים טיפולים תרופתיים, לערבב עם מדיום חדש ולהחיל במהלך STE זהp. הערה: מבחנים מסוימים עשויים לדרוש תקשורת אלטרנטיבית. לדוגמה, כמו פנול ריכוזים בסרום אדום וגבוה להפריע assay לשחרור LDH, DMEM אדום ללא פנול השלימו עם אלבומין 1% שור (BSA) (w / v), 2 מ"מ L- גלוטמין, ו פירובט סודיום 1 מ"מ היה מנוצל עבור ניסויים אלו. לאחר יושם מדיום חדש, בזהירות למקם להכניס קרום חדיר 0.4 מיקרומטר סטרילי בכל טוב. בצע פעולה זו במנדף זרימה למינרית, ולהשתמש מלקחיים סטרילי להעביר את כנס הקרום החדיר לבאר כל אחד. החל תרבית תאים בינוני טריה לתא העליון של כל אחד גם על פי הוראות היצרן. לקבלת בתנאים המתוארים כאן, להחיל 1 מ"ל בינוני לכל טוב במשך 6 צלחות היטב או 0.1 מ"ל בינוני לכל טוב במשך 24 צלחות היטב. החל נפח מתאים של תרביות חיידקים מנורמלות (ראה סעיף 1) לתא העליון של המערכת הכנס קרום החדירה. השתמש בינוני חיידקים עבור contr הנגועטיפולי ol. לקבלת התוצאות שתוארו כאן, להוסיף 25 μl של תרבויות המנורמלות לכל תא במשך 24 צלחות היטב ולהוסיף 100 μl של תרבויות לכל תא במשך 6 צלחות היטב. הערה: במחקרים אלה, סוג-בר או GAS המוטציה יושם לארח תאים בכל משרד פנים של 10. משרד פנים חושב על בסיס המספרים תא אוקריוטים הסופיים (למשל 2 x 10 6 תאים / טוב), כך 10 פעמים כמה חיידקים נוספו לכל תא מארח בתחילת תקופת הזיהום (למשל 2 x 10 7 CFU לכל טוב). משרד הפנים מתאימים ישתנו בהתאם מינים של חיידקים שונים ועם ניתוחי מעקב הרצויים. הערה: בנוסף לשימוש בינוני חיידקים עבור פקדים נגועים, שולט שימושיים נוספים עבור יישומים מסוימים של טכניקה זו עשויה לכלול חיידקים חומים שחוט או בינוני חיידקים בילו להשוואה. דגירת תאים נגועים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. אוסף דוגמאות 4. <ol> כדי לאסוף בינוני תרבית תאים, lysates התא המארח, או coverslips זכוכית עם תאים שלמים עבור מעקב ניתוחים, להתחיל על ידי הסרת להוסיף קרום חדיר בזהירות עם מלקחיים סטרילית. להערכת Protiens מארח המופרש: אסוף המדיום מהאולם התחתון לתוך צינורות 1.5 מ"ל. הימנע מפריע בשכבה במהלך איסוף. צנטריפוגה דגימות ב 14,000 RCF במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת הסלולר. הסר את כל אבל 50 μl של supernatant לצינור ולאחסן 1.5 מ"ל טריים ב -20 ° C או להשתמש מיד. לקבלת הערכה של התא המארח Lystates: בעדינות לשאוב את המדיום מעל בשכבה של תאי מארחים. הימנע מפריע בשכבה, מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן מדגם. יש לשטוף את התאים פעם עם 1x PBS. לשאוב בעדינות PBS. מייד להחיל נפח מתאים של חיץ תמוגה קר כקרח כדי להשיג את ריכוז החלבון הרצוי, דגירהדגימות קרח במשך 15 דקות. החל בין 200 μl ו 350 μl של חיץ תמוגה לכל טוב של כל צלחת 6 היטב להשגת ריכוזי חלבון בין 0.5 ו -1.5 מ"ג / מ"ל. הערה: מאגר תמוגה שימוש במחקרים אלה הורכב מים ללא יונים, 1% (v / v) תחליף P40 Nonidet, קוקטייל מעכב phosphatase, וקוקטייל מעכב פרוטאז. ריאגנטים ספציפיים המפורטים בסעיף חומרים וציוד. השתמש מגרד תא כדי לנתק את התאים מפני שטח הצלחת של כל טוב ו פיפטה את כל התוכן של כל אחד גם לתוך צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה דגימות ב 14,000 RCF במשך 20 דקות ב 4 ג. כדי להעריך רכיבים lysate מסיסים, להסיר את supernatant לצינור ולאחסן טרי ב -20 C או להשתמש מיד. כדי להעריך רכיבי lysate מסיסים גרעיניים או אחרים, שומר לעצמנו את הגלולה ולאחסן ב -20 C או להשתמש מייד. לקבלת הערכה על ידי הדמית Immunofluorescence: כפי שבינוני פיראט ולשטוף תאים PBS קר 1x. תקן תאים לילה paraformaldehyde 4% (PFA) פתרון PBS (w / v). הערה: במחקרים אלה, 1 מיליליטר של PFA נוסף לכל טוב של כל צלחת 6 היטב. 5. אפליקציות מוצעות מארח ניתוח התמרה איתותים ידי SDS-פייג 'המערבי סופג אסוף lysates התא המארח כמפורט בסעיף 4.3. קביעת ריכוז החלבון של כל lysate מדגם ידי חומצת bicinchoninic (BCA) assay או סטנדרטי חלבון באמצעות שווה 30. לנרמל ריכוזי חלבון בין דגימות לפני טעינת והפעלה של דגימות על ג'ל polyacrylamide 4-15% או 31 חלופה מתאימה. לנרמל ריכוזים מדגם ידי pipetting אותה כמות חלבון מכל מדגם (למשל 20 מיקרוגרם) לתוך צינור מ"ל 1.5 חדשים הוספת כמויות משתנות של חיץ תמוגה (נפח חיץ = הנפח הכולל – נפח דגימהמוסף) על צינור אחד להפוך את הנפח הכולל (למשל 50 μl) ושווי ריכוז החלבון הסופי ברחבי דגימות. העברת דגימות פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום (או שווה ערך). לקבלת התוצאות שתוארו כאן, להעביר דגימות ב 25 וולט עבור שעה 2 לפני הגדלת המתח 70 וולט עבור 45 דקות נוספות. השתמש חיץ העברת מורכב 200 בסיס מ"מ טריס, 1.5 מ 'גליצין ו -20% מתנול (V / V) במים deionized. ממברנות בלוק 5% BSA + 0.1% Tween 20 טריס שנאגרו מלוחים (TBS). התאם מבוסס בהתאם על המלצות היצרן עבור הנוגדן לשמש. דגירה ממברנות עם נוגדנים עיקריים בין הלילה ב 4 ° C.. השתמש ב יצרן מומלץ דילול. לשטוף ממברנות עבור 1.5 שעות ב TBS + 0.1% Tween 20; לרענן חיץ כל דקות 10-15. דגירה עם חזרת Peroxidase (HRP), מצומדות נוגדנים משני בדילול של 1: 5000 עבור 1.5 שעות ב חדר לטמפרטורותיור. לשטוף ממברנות עבור 1.5 שעות ב TBS + 0.1% Tween 20; לרענן חיץ כל 10 – 15 דקות. דגירה ממברנות עם מגיב זיהוי chemiluminescence לפני פיתוח על סרט על פי הוראות היצרן. שיטות זיהוי אחרות עשויות לשמש רצוי. תא מארח Immunofluorescence מכתים והדמיה תקן coverslips המכיל תאי מארח כמפורט בסעיף 4.4. הסר פתרון PFA ולשטוף coverslips המכיל תאים שטופלו שתי פעמים PBS, aspirating בין שוטף. הערה: PFA הוא רעיל מאוד וחייב להיות מסולק כראוי. חסום את coverslips עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר PBS עם 1% (w / v) בסרום עז נורמלי, 2% (v / v) טריטון X-100, ו -0.5% (v / v) Tween 20. לשטוף coverslips עם PBS למשך 30 דקות, מרענן למאגר כל 10 דקות. דגירה coverslips עם נוגדן ראשוני ביחס 1:50 (או כפי המומלץ על ידי היצרן) בחסימת solution לילה ב 4 מעלות צלזיוס. שטפו את coverslips עבור 1.5 שעות ב PBS, לרענן את חיץ כל 30 דקות. דגירה coverslips עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר ב נוגדנים משני (נגד ארנב עיזים IgG AlexaFluor488 שימש למחקרים אלה) באמצעות יחס של 1: 200 של נוגדן חסימת פתרון. לשטוף coverslips עבור שעה 1, מרענן למאגר כל 20 דק '. החל כתמים רצויים. הערה: מחקרים אלה נוצלו DAPI (גרעיני כתם) ו rhodamine-phalloidin (כתם יקטין) על יחסים של 1: 1,000 בחסימת פתרון. דגירת coverslips עם כתמים גרעיניים יקטינו למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף coverslips ב PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לרענן את חיץ כל 10 דקות. הר coverslips על שקופיות זכוכית באמצעות הרכבה בינונית. אפשר coverslips להגדיר בשקופיות לילה לפני איטום והדמיה. לקבלת התוצאות שתוארו כאן, לאסוף תמונות על usi מיקרוסקופ פלואורסצנטיng מטרת 20X סטנדרטית. השתמש ImageJ ומיקרוסקופ הדמיה תוכנה לעבד את התמונות שנתפסו. Assay מוות של תאים Ethidium homodimer לשאוב בינוני מבאר כל ולשטוף תאים פעמיים עם PBS סטרילית. החל homodimer-1 ethidium 4 מיקרומטר PBS. דגירה תאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. לקבוע את רמת הקרינה באמצעות קורא צלחת מוגדר 528 עירור ננומטר 617 פליטה ננומטר עם ערך סף של 590 ננומטר. להוסיף 0.1% (w / v) סאפונין לכל הקריאה הראשונית היטב הבאים ולאפשר את הצלחת דגירה 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר (עם נדנדה) לפני שתקראו את הסעיף צלחת בשנית על אותן הגדרות. לקבוע permeabilization קרום אחוזים בנפרד עבור כל טוב על ידי חלוקת הקרינה הראשונית קריאה (שלאחר הטיפול) על ידי הקרינה בקריאה שנייה (שלאחר סאפונין). Assay קביעת ATP <li> איסוף lysates כמפורט בסעיף 4.3 לעיל. לנרמל את רמות חלבון lysates באמצעות assay BCA או 30 דומים. קביעת רמות הסלולר ATP באמצעות ערכת נחישות ATP מבוסס הארה או שוות ערך על פי הוראות היצרן. לנרמל ערכים שטופלו על דגימות שליטה הנגועות המקבילות. Assay שחרור LDH בעקבות זיהום, לאסוף supernatants כמפורט בסעיף 4.3. הערכת שחרור LDH באמצעות ערכת זיהוי רעילה לשחרור LDH פי הוראות היצרן.

Representative Results

פרוטוקול מערכת זיהום הקרום החדיר מבוסס הכנס פתח לחקר גורמי חיידקיים המופרשים הוא מפורט באיור 1. מערכת זו מתבססת על הפרדת חיידקים ותאים מארחים באמצעות קרום נקבובי כדי להעריך את ההשפעות של גורמי חיידקיים מופרשים, במקרה זה Streptolysin S (SLS), על תגובות מארחות כגון שלמות קרום מארח, כדאיות הסלולר, הולכים אותות סלולריים, וגרם תא מארח מופרשים. איור 2 מספקים נתונים כתמים מערבי נציג הוכחת כי מערכת זו ניתן להשתמש כדי להעריך את השינויים בהפעלת קשר חלבונים עצמאיים איתות מארח. באופן ספציפי, הנתונים נציג להראות משופרים באופן משמעותי הפעלת MAPK p38 בנוכחות זנים להפקת גז-SLS. מערכת זו יכולה להיות מיושמת גם כדי להמחיש את ההשפעות של גורמי חיידקיים המופרשים על לוקליזציה חלבון מארח ידי מיקרוסקופ immunofluorescence (<strong> איור 3). הנתונים מראים הפעלת SLS התלוי של מתווך מפתח דלקת B קאפה פקטור הגרעיני (NFκB), אשר translocates מן הציטופלסמה לגרעין באקטיבציה 21. תוצאות איורים 2 ו -3 עולות כי הן SLS תלויות תגובות איתות דלקתיות אינן דורשות מגע ישיר בין החיידקים ותאי מארח. כמו בניסויים קודמים כבר הוכיחו SLS התלוי p38 והפעלת NFκB במודלי זיהום ישירים 21, רמות דומות של p38 או NFκB הפעלה בין השלושה זני הגז במערכת הכנס מבוסס הקרום החדיר היה הראה כי התגובה נדרשת קשר ישיר בין חיידקים ותאים המארח. איור 4 מראה כי מערכת זיהום זה יכול להיות מיושם על מנת להעריך שינויים תלויי הרעלן cytotoxicity מארח באמצעות מבחני שחרור homodimer ethidium ו LDH. עדות לכך הוא על ידי i העלייה המשמעותיn הוא קרום permeabilization וב שחרורו של LDH מתאי מארח נחשף זני גז המכילים SLS לעומת תאים או תאים נגועים חשופים זן SLS המחסר. שינויים אלו cytotoxicity אינם מיידיות, כמו השפעות משמעותיות אינן נראות עד לאחר פגיעת 12 שעות במקרה של permeabilization הממברנה 16 שעות במקרה של שחרור LDH. הנתונים נציג להמחיש את החשיבות של בחירת נקודות זמן מתאימות ותנאי זיהום להערכת התגובות המארחות אלה. בנוסף מאפשר להערכת שינויי איתות מארח cytotoxicity, מערכת הקרום החדיר הזיהום מבוסס הכנס ישימה המחקר של שינויים מטבוליים כגון קביעה מדויקת של רמות ATP המארח על ידי מניעת זיהום חיידקים של lysates תא מארח (איור 5) . נתונים אלה מצביעים על אובדן משמעותי של ATP keratinocyte בתגובה לזיהום גז על ידי 16 שעות שלאחר זיהום, עם הפסד ATP משופרת in בנוכחות SLS. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם עליות רעלן תלוי שנצפו איתות מתח בתגובת מארח cytotoxicity. איור 1: התרשים של חדיר ממברנה הכנס מבוסס זיהום מערכת פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעות של גורמי חיידקיים מופרשים בתא פונדקאי קרטינוציטים אדם הם מצופים בתא התחתון גדלו ל -90% מפגש.. קרום קולגן מצופה עם 0.4 מיקרומטר נקבוביים מפריד לתאי העליון ותחתון, וחיידקים מתווספים בחדר העליון של המערכת הכנס קרום החדירה עבור תקופת ההדבקה הרצויה. תרבית תאי supernatants ותאי מארח עשוי להיאסף לאחר תקופת הזיהום מנוצל עבור מגוון רחב של ניתוחים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותרשל נתון זה. איור 2:. הקרום החדיר מערכת הזיהום הכנס המבוססת יכולה להיות מנוצלת עבור תא מארח Lysate ניתוח על ידי SDS-PAGE ו מערבי סופגים הנתונים נציג להוכיח כי SLS משפר שפעול מסלול MAPK p38 ב קרטינוציטים נגועים. (א) HaCaTs נדבקו GAS עבור 7 שעות באמצעות מערכת זיהום להוסיף קרום חדיר (ב משרד הפנים = 10) ו lysates הוערכו לצורך הפעלה של p38. (B) צפיפות משלושה מערבי עצמאי כתמים בוצעה על מנת לכמת את ההפעלה היחסית של p38 בתגובת GAS'infection. ממוצעים משלושה ביולוגי משכפל נראים לעין, עם ברי שגיאת מייצג סטיית התקן. הפעלה יחסית של p38 מיוצג רמת חלבון פוספורילציה / סה"כ. מובהקות סטטיסטיות נקבעו לעומתתאים נגועים. P-הערך הכולל נקבע על ידי ANOVA (p = 0.0063). הבדיקות של Dunnett בוצעו פוסט הוק להשוות כל תנאי לשליטה הנגועה המקבילה מתכוון. *, P = 0.01-0.05; **, P = .001-.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, P <0.0001. נתון זה יש הבדל בין פלהרטי et al. 2015 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3:. הקרום החדיר מערכת הזיהום הכנס המבוססת מאפשרת ההדמיה של שינויי איתות מארח ידי Immunofluorescence המיקרוסקופי הנתונים נציג להראות כי Streptolysin S משפר פרו-דלקתי איתות באמצעות הפעלת NFκB. קרטינוציטים אדם HaCaT נדבקו GAS לעבר M OI 10 עבור 8 שעות באמצעות קרום החדיר מערכת זיהום כנס המבוססת. (A ו- B) לוקליזציה גרעינית של NFκB הוערכה על ידי הדמית immunofluorescence. אחוז התאים המקומיים גרעיניים חושב על ידי ספירת מספר תאים בם NFκB היה translocated מן הציטופלסמה לגרעין עבור שדה נתון החלוקה מספר כי במספר הכולל של תאים עבור אותו השדה. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. (א) הממוצע של שלושה משכפל ביולוגי מיוצגים עבור כל תנאים במוטות שגיאה מייצגות סטיית התקן. P-הערך הכולל נקבע על ידי ANOVA; p <0.0001. הבדיקות של Dunnett בוצעו להשוות כל תנאי למצב השליטה הנגוע המקביל. *, P = 0.01-0.05; **, P = .001-.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, P <0.0001. נתון זה יש הבדל בין פלהרטי et al. 21 2015./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4:. קרום חדיר מערכת זיהום הכנס מבוסס מאפשר לקביעת בקטריאלי בתיווך ממברנה Permeabilization ו Cytotoxicity בהעדר מגע ישיר בין חיידקים ותאים מארח הנתונים נציג להוכיח כי הכדאיות keratinocyte פוחתת בנוכחות רעלן SLS פעיל . GAS – מושרה המוות של תאים הוערך בתאי HaCaT בנוכחות WT, SLS מחסר או סגת של GAS קרטינוציטים נחשפו לגז באמצעות מערכת הקרום החדיר זיהום מבוסס כנס עבור 8-16 שעות ב משרד פנים של 10. (. א) הכדאיות הוערכה על ידי assay homodimer ethidium או (ב) assay לשחרור LDH. בשני פאנלים, 3 מחדשplicates הם ממוצעי ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. חשיבות עבור כל נקודת זמן נקבעה על ידי ANOVA (א) 8 שעות, p = 0.0241; 12 שעות, p <0.0001) ב (8 שעות, p = 0.0287; 12 שעות, p = 0.1977; 16 שעות, p = 0.0031. הבדיקות של Dunnett בוצעו כדי להשוות אמצעים מכל מצב זיהום wild-type עבור נקודת הזמן המתאימה. *, P = 0.01-0.05; **, P = .001-.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, P <0.0001. נתון זה יש הבדל בין פלהרטי et al. 2015 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: הקרום החדיר הכנס מבוססת מערכת הזיהום מאפשרת קביעה מדויקת של רמות המארח ATP על ידי מניעת Bacterial זיהום של תא מארח Lysates. הנתונים נציג להפגין אובדן SLS התלוי של ATP במהלך סטרפטוקוקלית זיהום קבוצת א '. תאי HaCaT נדבקו GAS עבור 8-16 שעות באמצעות קרום החדיר מערכת זיהום כנס המבוססת. משכפל טכני (n = 3) מן לשכפל ביולוגי נציג אחד (2 x 10 6 תאים לדגימה) היו בממוצע עבור כל תנאי, עם ברי שגיאת מייצג סטיית התקן. P-ערכים הכוללת נקבעו על ידי ANOVA (12 שעות, p <0.0001; 16 שעות, p <0.0001). הבדיקות של Dunnett בוצעו להשוות כל תנאי עם זיהום wild-type עבור נקודת הזמן המתאימה. *, P = 0.01-0.05; **, P = .001-.01; ***, P = 0.0001-0.001; ****, P <0.0001. נתון זה יש הבדל בין פלהרטי et al. 2015 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

בזאת מתוארת שיטה באמצעות מערכת זיהום קרום חדיר מבוססי הכנס כדי לבחון את ההשפעות של הרעלן חיידקי Streptolysin S על קרטינוציטים אדם אפיתל במערכת חוץ גופית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לחקר גורמים ארסיים חיידקים מופרשים אחרים, כמו גם סוגי תא מארח חלופיים. מערכת זו מספקת מספר יתרונות שפותחו לאחרונה על שיטות ניסיוניות לנצל רעלים מטוהרים או supernatants חיידקי מסוננים 1 – 3,8,18 – 20. הקרום החדיר הכנס מבוססת המערכת מספקת מנה נשמרה כל זמן של רעלן החיידקים הרלוונטי לארח תאים כפי שהוא מיוצר, המאפשר פעילות הרעלן מקסימלי להישמר וגם ולהגדיל עקביות בין ניסויים. בנוסף, מערכת זו תחקה בצורה טובה יותר בתנאים פיסיולוגיים בכך שהוא מאפשר הגורם המופרש לצבור לאורך זמן כמו הזיהום מתקדם ועל ידי eliminating צורך לבחור ריכוזי רעלן ספציפיים באופן שרירותי להחיל לארח תאים. יתר על כן, מערכת זו גם תספק אמצעי החוקרים להעריך אם גורם חיידקים של העניין מועבר לארח תאים באופן מגע תלוי. לתקשר-תלות לעתים קרובות נבחנת דרך הדור של מוטנטים חיידקי isogenic חסרי עמידה או באמצעות חומרים כימיים המונעים דבקה. המערכת המתוארת כאן תספק אלטרנטיבה פשוטה להשלים או להחליף הגישות המסורתיות הללו.

בנוסף היישומים נבדקו בסעיף 5 לפרוטוקול, יישומים אחרים שאליהם מערכת זיהום זה יכול בקלות להיות מותאם כוללים איסוף דגימות עבור מערכים ציטוקינים מבחני ELISA. בשני המקרים הללו, פרוטוקול דומה לזה שתואר עבור מבחני שחרור LDH יכול להיות אחריו. אמנם לא מוצג כאן, מערכת זו נעשה שימוש כדי לאסוף ביעילות דגימות התא המארח להיותnalyzed ידי cytometry הזרימה. ביישום זה, להכניס את הקרום החדיר מוסר בעקבות תקופת ההדבקה, התאים נשטפים להסרת בינוני תרבית תאים, טריפסין מוחל לאפשר איסוף של התאים לניתוח. ההפרדה הפיסית של חיידקים מתאים מארח היא שימושית במיוחד עבור יישום זה כי זה עוזר למנוע ההיווצרות של אגרגטים גדולים המורכבים של חיידקים דבקים ותאי מארח שיכול להפריע בכל דרך אחרת ספירת תאים מדויקת ידי cytometer את הזרימה.

למרות תגובות מארחות עקביות מאוד נצפו כאשר משווות את התוצאות של מחקרי הזיהום מבוסס להוסיף קרום החדיר עם מחקרי זיהום ישירים מסורתיים, כמה הבדלים בולטים ב קינטיקה של תגובות מארח אלה נצפו 21. לדוגמא, שינויי איתות מארח cytotoxicity המבוסס הקרום לקחת 30-50% יותר להתרחש במודל זיהום הקרום החדיר מבוסס כנס מ corלהגיב מודלי זיהום ישירים. כיוון שמערכת הקרום החדירה מבוסס הכנס דורשת בינונית לחול על התאים העליונים ותחתונים של כל הטוב, המערכת שפותחה עבור המחקרים שתוארו כאן נדרשה גידול של 30% בנפח בינוני הכולל לכל טוב לעומת מקביל מודלי זיהום ישירים השתמשו בעבר 21. זה הבדל בנפח בינוני כולל, יחד עם המרחק המוגדל בין חיידקים ותאי מארח כאשר אסור במגע ישיר, סביר מגדיל את המשך הזמן שלוקח SLS כדי לנטרל באמצעות המדיום להגיע תאי מארחים ולעורר השפעות שנצפו. בנוסף, קרום חדיר הכנס מבוססי מערכת מסיר גורמים ארסיות GAS רבים העשויים לתרום לארח נזק לתאים; בהיעדר גורמים נוספים אלה במערכת זו הוא גם עשוי לתרום עיכוב מות תא מארח וייזום אירועי איתות מארח לעומת זיהום ישיר 21. גורמים אלה יש לשקולבעת תכנון ניסויים להעריך רכיבי חיידקי מופרשים אחרים.

כדי לזהות את התנאים הכי המשמעותיים לבדיקת ההשפעות של גורמי חיידקיים מופרשים בתא פונדקאי, בדיקות מגוון של מועדים לפי שעון עבור כל יישום של מערכת הזיהום מבוסס להוסיף קרום החדיר מומלצת. חשוב לשקול ובאילו תנאי הגורם הארסי הספציפי של העניין מופק בצורה אופטימלית (שלב יומן למשל, בשלב נייח, בתגובה לאותות סביבתיים מסוימים, וכו ') על מנת לבחון את השפעותיו בהצלחה. בניסויים התמקדו בהערכת שינויים בחלבונים מארחים איתות, היה צורך לבחור מועדים לפי שעון שאפשרו זמן מספיק לצורך SLS להגיע תאים המארח להיות מיוצר בכמויות מספיק כדי לגרום איתות משנת 21. במקביל, הערכה של שינויים מארח צורך איתות להתנהל לפני permeabilization קרום-induced SLS, כמו ג את האפקט הזהomplicates גביית lysates התא המארח לניתוח. מוות של תאים המושרה על ידי SLS יכול להיבחן בצורה אופטימלית בשני המודלים זיהום מבוססי להוסיף קרום חדיר ישיר כמה שעות לאחר תחילת האירועים איתות דיווחו 21. יתר על כן, בבחירת נקודות זמן של עניין, זה גם חשוב לוודא כי החיידק הנלמד אינם מסוגל לחדור דרך הממברנה להכניס הנקבובית במהלך תקופת הלימודים. לייצור רכיבי חיידקים מסוימים על פני תקופה ממושכת עלול לשבש את שלמותו של הקרום ולאפשר מעבר של חיידקים אל המגירה התחתונה. על מנת לקבוע האם מדובר בבעיה פוטנציאל במערכת של עניין, זני חיידקים כדי להיחקר ניתן ליישם בחדר העליון של קרום חדיר להכניס מערכת מבוססת על מגוון של נקודות זמן. בכל נקודת זמן, את הכנס ניתן להסיר בזהירות את המדיום מהאולם התחתון ניתן לאסוף מנוצל שותף מושבת תקןassay unting (ראה סעיף 1.5). אם אין מושבות נוצרות ממדיום תרבית תאים בתא התחתון, קרום הכנס ניתן להניח להיות מניעת המעבר של חיידקים ביעילות בנקודת זמן עומס חיידקי נבדק.

מרכיב נוסף עיצוב ניסיוני כי הוא צפוי לדרוש אופטימיזציה עבור הניתוח היעיל של גורמי חיידקיים מופרשים הוא הריבוי של זיהום (משרד פנים). משרד הפנים מתייחס ליחס של תאים חיידקיים לכל התא המארח, ולכן מושפעת confluency התא המארח בעת זיהום במספר יחידות המושבה להרכיב בקטריאלי (CFU) להחיל את התאים. במחקרים אלה, תאי keratinocyte גדלו ל -90% confluency, אשר אפשר תאים אלה יוצרים monolayer מלוכדת עם צומת הדוקים ללא פגע. שיקול מחושב של הארגון הפיזיולוגי של תאי המארחים להיחקר יש צורך לבחור confluency מתאים לניסויי זיהום. ברגע approprמספר iate של תאי מארחים לכל נקבעת היטב, CFU חיידקים מתאים ניתן לחשב מבוסס את משרד הפנים הרצוי. במחקרים שתוארו כאן, GAS יושמה לארח תאים בכל פנים של 10. משרד פנים מתאימים תשתנה בהתאם חיידקים שונים ועם ניתוחי מעקב הרצויים. התחלה נמוכה משרד הפנים הוא בדרך כלל יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומאפשר גורם חיידקי עניין לצבור מספיק לאט כדי ללכוד שינויים עדינים איתות תא המארח לפני שינויים דרמטיים כדאי תא מארח ניכרים. MOIs הגבוהה משמשת במחקרים רבים להערכת רעילות, אך השפעה זו גם יכולה להיות מושגת על ידי מתחיל עם משרד פנים נמוך ומאפשרים הזיהום להתקדם לתקופה ארוכה יותר של זמן. חשוב לקבוע CFU מדויק תולדת צפיפות אופטית עבור כל זני החיידקים להיבדק, כמו מוטציות isogenic עלולות להיות בעל שיעור צמיחה שינה לעומת חיידקי wild-type ועלול ולכן המחייבות גבוהה או נמוך CFU יתווסף לכל היטבלהבטיח השוואה מתאימה התגובה המארחת בין זנים. במקרים בם תאי המארחים היונקים הנלמד מסוגלים להרוג חיידקים או עיכוב הצמיחה שלהם או אם צמיחת nonsynchronous בין זני חיידקים חשודות, זה יכול להיות גם שימושי לבצע מחקרים על מנת להעריך את עומס החיידקים הסופי בסוף תקופת ההדבקה. זה יכול להיות מושלם על ידי איסוף התוכן של הכנס החדיר וביצוע assay ספירת מושבה דומה לזה שתואר בסעיף 1.5 של ההליך.

בחירת בארות בגודל המתאימה עבור assay הרצוי היא גם חשובה להשגת תוצאות אופטימליות. מוסיף קרום חדיר זמינים במגוון גדלים, אך התוצאות הכי עקבית עבור המחקרים המוצגים כאן נצפו באמצעות מוסיף המיועד 24 היטב 6 צלחות תרבית הרקמה היטב. בגדלים הכניסו אלה קלים יחסית להתמודד עם מלקחיים סטריליות, וקלות המניפולציה היא קריטית מנעתיing העברה רצויה של חיידקים מהתא העליון לתא התחתון של הפיר. בניסויים מעורבים בגביית lysates תא המארח, 6 מנות גם לספק מספר תאים מתאים לכל מצב עבור רוב הניתוחים הם גדולים מספיק כדי להכיל מגרדי תאים לאיסוף דגימה. עבור מבחני cytotoxicity שבו תאי המארחים להישאר חסיד מסומן עם פלורסנט או לצבוע colorometric שניתן למדוד על קורא צלחת (assay homodimer למשל ethidium, assay הרחקת trypan הכחול), שימוש 24 צלחת היטב עם מוסיף המקביל הוא מוּמלָץ. עבור ניסויים שבם תאים בינוניים תרבות ייאסף ונותחו (שחרור LDH למשל, מחקרים ציטוקינים) את 24 טוב או 6 צלחות גם עשויות לשמש, אם כי הבארות הקטנות בדרך כלל לספק כרכי מדגם נאותים של ניתוחים אלו ולמזער שימוש הנדרש ריאגנטים. בסך הכל, השיטה הוא תכליתי מאוד יכול להיות מותאם לפי הצורך להכין samples עבור יישומים ומעקב רבים.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.

Materials

Todd-Hewitt broth Acumedia 7161A Use appropriate broth for bacterial species of interest.
BioSpectrometer Eppendorf basic model Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. 
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713 Other brands are suitable.
Agar Sigma A1296-1kg Other brands are suitable.
HaCaT human epithelial keratinocytes Gift from lab of Victor Nizet.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11995-073 Use appropriate media for cell line of interest.
Fetal Bovine Serum (FBS) Biowest S162H Use appropriate media additives for cell line of interest.
10cm tissue culture dishes Nunc 150350 Other brands are suitable.
6 well tissue culture dishes CytoOne cc7682-7506 Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
24 well tissue culture dishes CytoOne cc7682-7524 Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
Glass coverslips Fisherbrand 12-541-B These must be autoclaved prior to use for cell plating.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 10010-023
Phenol Red Free DMEM Life Technologies 31053028 Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
L-glutamine Gibco 25030149 Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Sodium pyruvate Gibco BP356100 Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) Corning 3540
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) Corning 3595
Forceps Fisher 3120018 These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts.
Cell scrapers Fisherbrand 08-100-241 These are only required for the collection of cell lysates.
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500 TOXIC.  This is only required for immunofluorescence imaging.
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit Pierce 23227 Other protein quantification assays may be used.
Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels BioRad 4561083 Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest.
Electrophoresis cassette supplies BioRad 1658063 Only required for Western Blotting.
Electrophoresis power supply BioRad 1645050 Only required for Western Blotting.
Western blot transfer cassette BioRad Only required for Western Blotting.
Polyvinylidene (PVDF) Membrane EMD Millipore IPVH00010 Only required for Western Blotting.
Tween 20 Sigma P1379-500mL
Rabbit IgG-HRP secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc2030 The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
Mouse IgG-HRP secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc2031 The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody Cell Signaling 4511 Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Total p38 MAPK antibody Cell Signaling 8690 Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 Molecular Probes A-11034 Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection.
LumiGLO Detection Reagent KPL 54-61-00 Only required for Western Blotting with detection on film.
Detection film Biodot BDB57 Only required for Western Blotting with detection on film.
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope Nikon Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses.
Normal goat serum Thermo Scientific 31873
Triton X-100 Sigma T9284-500mL
DAPI nuclear stain Cell Signaling 4083 Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Rhodamine-phalloidin actin stain Molecular Probes R415 Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Only required for immunofluorescence imaging.
Ethidium homodimer 1 Molecular Probes E1169 Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Spectramax M5 Microplate Reader Molecular Devices Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable.
Saponin Sigma 47036-50G-F Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Molecular Probes ATP Determination Kit Life Technologies A22066 Other kits are likely to be suitable.
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release Roche 11644793001 Other kits are likely to be suitable.
Nonidet P40 Substitute Sigma 74385-1L Other suppliers are suitable.
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78420B Other cocktails are likely to be suitable.
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free Sigma S8830-2TAB Other cocktails are likely to be suitable.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Wiles, T. J., Dhakal, B. K., Eto, D. S., Mulvey, M. A. Inactivation of host Akt/protein kinase B signaling by bacterial pore-forming toxins. Mol Biol Cell. 19 (4), 1427-1438 (2008).
  2. Kao, C. Y., Los, F. C. O., et al. Global functional analyses of cellular responses to pore-forming toxins. PLoS Pathog. 7 (3), e1001314 (2011).
  3. Ma, X., Chang, W., Zhang, C., Zhou, X., Yu, F. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils. PLoS ONE. 7 (4), e34970 (2012).
  4. Sumitomo, T., Nakata, M., et al. Streptolysin S contributes to group A streptococcal translocation across an epithelial barrier. J Biol Chem. 286 (4), 2750-2761 (2011).
  5. Miyoshi-Akiyama, T., Takamatsu, D., Koyanagi, M., Zhao, J., Imanishi, K., Uchiyama, T. Cytocidal effect of Streptococcus pyogenes on mouse neutrophils in vivo and the critical role of streptolysin S. J Infect Dis. 192 (1), 107-116 (2005).
  6. Goldmann, O., Sastalla, I., Wos-oxley, M., Rohde, M., Medina, E. Streptococcus pyogenes induces oncosis in macrophages through the activation of an inflammatory programmed cell death pathway. Cell Microbiol. 11 (1), 138-155 (2009).
  7. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  8. Ratner, A. J., Hippe, K. R., Aguilar, J. L., Bender, M. H., Nelson, A. L., Weiser, J. N. Epithelial cells are sensitive detectors of bacterial pore-forming toxins. J Biol Chem. 281 (18), 12994-12998 (2006).
  9. Stassen, M., Müller, C., et al. The streptococcal exotoxin streptolysin O activates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase- and protein kinase C-dependent pathways. Infect Immun. 71 (11), 6171-6177 (2003).
  10. Porta, H., Cancino-Rodezno, A., Soberón, M., Bravo, A. Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins. Peptides. 32 (3), 601-606 (2011).
  11. Walker, M. J., Barnett, T. C., et al. Disease manifestations and pathogenic mechanisms of group a Streptococcus. Clin Microbiol Rev. 27 (2), 264-301 (2014).
  12. Carapetis, J. R., Steer, A. C., Mulholland, E. K., Weber, M. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis. 5 (11), 685-694 (2005).
  13. Cunningham, M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev. 13 (3), 470-511 (2000).
  14. Molloy, E. M., Cotter, P. D., Hill, C., Mitchell, D. A., Ross, R. P. Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nature Rev Microbiol. 9 (9), 670-681 (2011).
  15. Datta, V., Myskowski, S. M., et al. Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection. Mol Microbiol. 56 (3), 681-695 (2005).
  16. Lee, S. W., Mitchell, D. A., et al. Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5879-5884 (2008).
  17. Mitchell, D. A., Lee, S. W., et al. Structural and functional dissection of the heterocyclic peptide cytotoxin streptolysin S. J Biol Chem. 284 (19), 13004-13012 (2009).
  18. Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., et al. Characterization of Clostridium perfringens TpeL Toxin Gene Carriage Production, Cytotoxic Contributions, and Trypsin Sensitivity. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (6), 2369-2381 (2015).
  19. Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., Winterhalter, M., Zakharian, E., Balashova, N. Pore forming activity of the potent RTX-toxin produced by pediatric pathogen Kingella kingae: Characterization and comparison to other RTX-family members. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (7), 1536-1544 (2015).
  20. Carr, A., Sledjeski, D. D., Podbielski, A., Boyle, M. D., Kreikemeyer, B. Similarities between complement-mediated and streptolysin S-mediated hemolysis. J Biol Chem. 276 (45), 41790-41796 (2001).
  21. Flaherty, R. A., Puricelli, J. M., Higashi, D. L., Park, C. J., Lee, S. W. Streptolysin S Promotes Programmed Cell Death and Enhances Inflammatory Signaling in Epithelial Keratinocytes during Group A Streptococcus Infection. Infect Immun. 83 (10), 4118-4133 (2015).
  22. Guedon, J. T., Luo, K., Zhang, H., Markham, R. B. Monoclonal and Single Domain Antibodies Targeting β-Integrin Subunits Block Sexual Transmission of HIV-1 in In Vitro and In Vivo Model Systems. J Acquir Immune Defic Syndr. 69 (3), 278-285 (2015).
  23. Hu, D., Zhou, J., Wang, F., Shi, H., Li, Y., Li, B. HPV-16 E6/E7 promotes cell migration and invasion in cervical cancer via regulating cadherin switch in vitro and in vivo. Arch Gynecol Obstet. 292 (6), 1345-1354 (2015).
  24. Gangl, K., Waltl, E. E., et al. Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer. Int Arch Allergy Immunol. 166 (4), 291-296 (2015).
  25. Peng, X., Zhang, Q., Zeng, Y., Li, J., Wang, L., Ai, P. Evodiamine inhibits the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro via repressing MMP-2 expression. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1173-1184 (2015).
  26. Zheng, Y., Guo, J., et al. FoxM1 transactivates PTTG1 and promotes colorectal cancer cell migration and invasion. BMC Med Genomics. 8, 49 (2015).
  27. Losa, D., Köhler, T., et al. Airway Epithelial Cell Integrity Protects from Cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signals. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (2), 265-275 (2015).
  28. Cook, K. W., Letley, D. P., et al. CCL20/CCR6-mediated migration of regulatory T cells to the Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa. Gut. 63 (10), 1550-1559 (2014).
  29. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  30. Krieg, R. C., Dong, Y., Schwamborn, K., Knuechel, R. Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. J Biochem Biophys Methods. 65 (1), 13-19 (2005).
  31. Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).

Tags

Permeable Membrane InsertHost-pathogen InteractionsSecreted Bacterial ToxinsGAS InfectionHaCaT CellsCell SignalingMembrane PermeabilizationLDH Release

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Flaherty, R. A., Lee, S. W. Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells. J. Vis. Exp. (114), e54406, doi:10.3791/54406 (2016).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image