Транскрипционная Анализ нарождающегося РНК рыб<em> В Vivo</em> Трофобласта гигантские клетки или<em> In Vitro</em> Краткосрочные Культуры Ectoplacental Cone эксплантов
Summary
Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.
Abstract
Плацента является производным от одного экстра-эмбрионального происхождения, в трофэктодерме. В пери-имплантации мышиной бластоцисты, фресковая трофэктодерме клетки дифференцируются в первичные гигантские клетки трофобласта (ТГК) в то время как полярный трофэктодерме, закрывающая внутреннюю клеточную массу продолжает разрастаться позже дифференциации во вторичные ТГК. ТГК играют ключевую роль в развитии плаценты и имеют важное значение для успешной беременности. Исследование регуляции транскрипции специфических генов в процессе развития после имплантации может дать понимание развития ТГК. Клетки ectoplacental конуса (EPC) из эмбрионов на 7-7,5 дней гестации (E7-7.5), полученный из полярного трофэктодерме, дифференцироваться во вторичные 1 ТГК. ТГК может быть изучена на месте, на криостата участках эмбрионов на E7 , хотя количество ТГК очень низкая на данном этапе. Альтернативным средством анализа вторичного ТГК является использование краткосрочных культур отдельных ЕРС из Е7 эмбрионаs. Мы предлагаем технику , чтобы исследовать транскрипционный статус генов , представляющих интерес как в естественных условиях и в пробирке на уровне одной клетки с использованием флуоресцентных гибридизация (РНК FISH) в визуализировать зарождающихся транскриптов. Этот метод обеспечивает прямое считывание экспрессии генов и позволяет проводить оценку состояния хромосомного ТГК, которые являются большие endoreplicating клетки. Действительно, ключевой особенностью терминальной дифференцировки ТГК является то, что они выходят из клеточного цикла и пройти несколько раундов endoreplication.This подход может быть применен для выявления экспрессии любого гена, экспрессированный из аутосом и / или половых хромосом и может предоставить важную информацию в развития механизмы, а также плацентарные заболеваний.
Introduction
Млекопитающие трофобласта гигантские клетки (ТГК) образуют барьер между материнской и эмбриональных тканей. Они опосредуют имплантацию и вторжение зародыш в матку и играют решающую роль в развитии для формирования плаценты. Они производят несколько факторов роста (цитокины) и гормоны семейства и стероиды Пролактин / плацентарный лактоген, необходимого для эмбрионального роста и выживания. ТГК большие, Мононуклеированные и полиплоидных клеток с клеточного цикла, в endocycle, который состоит из чередующихся S и G фазы. В самом деле, являются endoreplicating ТГК – клетки, способные пройти несколько раундов синтеза ДНК без какого – либо разделения 2. Для того чтобы исследовать транскрипционный статус генов в естественных условиях, в ТГК по сравнению с другими эмбриональных и экстраэмбриональных типов клеток, зарождающейся РНК рыбы может быть выполнена в естественных условиях на криостата секций 3 на определенных этапах после имплантации. ТГК легко узнаваемы по разделам из-за Theiг большой размер, и их активность генов транскрипционных могут быть записаны, но их количество на ранних стадиях после имплантации низка. Недостаточность на Е7 ТГК эмбриональных секций, привели нас выполнять краткосрочные культуры эмбриональных тканей trophectodermal для получения дифференцированных в ТГК с целью изучения регуляции экспрессии генов в процессе развития трофэктодерме. Кроме того, для того, чтобы оставаться физиологическим, насколько это возможно, установленные клеточные линии, т.е. трофэктодерме стволовые клетки (TS) не всегда подходят для изучения механизмов развития генерации вторичных ТГК являются ценным инструментом для изучения патологических беременностей, связанных с дефектами в ТГК из-за аномального гена регулирование на мышах.
Трофобласта клетки ectoplacental конуса (EPC) являются предшественниками вторичных 4 ТГК. Спонтанное дифференцировку культивируемых ЭПК к вторичным ТГК ранее сообщалось 5. Однако, в отличие от первичных ТГК, исследований по вторичной ТГК диффереференцирование остаются ограниченными, presumablydue к трудностям изоляции EPC эксплантов свободной от каких-либо материнских или эмбриональных тканей. Мы адаптировали эти методы, чтобы выполнить РНК FISH на вторичных производных от ТГК индивидуального эмбриона на E7, на стадии развития после имплантации, где ТГК очень мало, но может быть получен из EPC предшественников. FISH РНК для анализа ядерных первичных транскриптов никогда не было сделано на уровне уровне одной клетки на вторичных ТГК. Это позволяет точный анализ транскрипции и был использован , чтобы показать эпигенетическую нестабильность на ТГК после имплантации стадии 3.
Классический пример эпигенетике у млекопитающих, инактивация Х-хромосомы (XCI) изучается в лаборатории Heard 6. В этом процессе одна из 2-Х-хромосом у самок инактивируется. Некодирующих транскриптов Xist пальто Х – хромосомы , из которых она выражается в женских клетках и вызывает молчанию большинства генов. Использование РНК FISH,формирующиеся транскриптов генов Х-хромосомой могут быть исследованы как можно накопление Xist РНК на неактивной Х – хромосомы (Xi). Здесь мы опишем процедуру для выполнения РНК FISH на участках после имплантации эмбрионов и на краткосрочных культурах EPC. Этот протокол адаптирован из тех , которые были использованы для изучения XCI в дифференциации женских эмбриональных стволовых клеток и эмбрионов предимплантационной 7-11. Мы приводим примеры из XCI в женских эмбрионов в естественных условиях, а также в пробирке ТГК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nascent РНК FISH представляет собой простой и чувствительный метод для одного анализа клеток транскрипционной активности в эмбриональных тканях на разных стадиях развития. Сила этого подхода является способность идентифицировать различные эмбриональные клоны на какой-либо конкретной стадии по морфологическим критериям. Однако это также требует, чтобы минимальный фон флуоресценции присутствует. Любой такой фон делает идентификацию различных эмбриональных регионов и типов клеток сложной задачей. Для обеспечения минимального фона, есть два важных шагов в этом протоколе. Первым из них является качество cryosection, а второй является эффективность (отношение сигнал-шум), РНК-FISH, которая зависит от уровня экспрессии генов и качества зонда. Что касается последнего, зонды поэтому всегда протестирована на культивируемые клетки на покровных стеклах (эмбриональные стволовые клетки или соматические клетки) перед использованием по разделам.
В этом протоколе, мы предоставляем йМетоды е требуется для проведения анализа FISH РНК на ТГК из двух различных типов подготовки проб (криостатные и первичных культурах эмбриональных эксплантов). Такой единый анализ клеток позволяет динамические изменения в экспрессии генов на разных этапах после имплантации необходимо оценить.
Методы мы описываем для генерации вторичного ТГК (на E7-7.5 стадиях после имплантации) были использованы в нашей лаборатории для изучения Х-хромосома инактивации модели экстра-эмбриональные линии, который состоит из этапов на ТГК после имплантации. Экстра-эмбриональное развитие у грызунов зависит от дифференциации ТГК. Действительно, ТГК имеют важное значение для плацентарного и, таким образом, эмбрионального развития. Дефекты в ТГК дифференциации вызывают эмбриональную летальность (для обзора см ссылку 15). Транскрипционной активности РНК с использованием ТГК FISH позволило нам продемонстрировать необычную Х – хромосомы статус инактивация такого типа клеток во время развития мыши 3.
<p claсс = "jove_content"> Методы, представленные здесь, чтобы получить и изучить вторичные ТГК могут быть применены для изучения молекулярных путей в развитии важных внеэмбриональной тканей они являются частью, как в нормальных, так и мутантных мышей. Эти подходы могут быть адаптированы для изучения развития ТГК и у других млекопитающих. Наш анализ включал использование диких эмбрионов типа мыши позволяет нам оценить транскрипционной активности различных генов в в естественных условиях и в ТГК ТГК в пробирке , полученных из EPC эксплантов. Этот метод может быть расширен до анализа трансгенных мышей и / или добавлением молекул ингибитора в культуральной среде. Мы успешно использовали этот метод РНК FISH на другом типе ТГК, такие как первичные, которые появляются ТГК на более ранней стадии развития мыши, E3.0 blastocyts, которые могут быть индивидуально культивировали в течение 4-5 дней, в течение которого развитые вырост, то ИВМ в окружении крупных первичных 16,17 ТГК. Нарождающиеся транскрипты разныегены , а также Xist можно визуализировать и количественно , используя тот же подход РНК FISH 3.Комбинированные иммунофлуоресценции и РНК рыбы также может быть выполнена на криостатные, а также в пробирке , культивируемых 3 ТГК. Это свидетельствует о том, что метод является достаточно надежным, так как первичные транскрипты в значительной степени подвержены деградации, и есть абсолютное требование РНКазных свободных соединений. IF / РНК FISH предоставляет дополнительную информацию об уровнях транскрипции, клеточной локализации и экспрессии белка, одновременно в данной клетке. Несмотря на то , участки залитой в парафин ткани использовались ранее для выявления возникающую РНК в опухолях человека , при сохранении морфологии 18 ткани, в наших руках, криостат секции являются более подходящими для сохранения как возникающую РНК и эпитопы , необходимое для обнаружения антител во время иммунофлюоресценции ,
В дополнение к РНК FISH, после IMmunofluorescence, хромосомная ДНК рыбы также могут быть выполнены на вторичных с использованием зондов , ТГК меченные флуорохромии аналогичными тем , которые используются для РНК – FISH 3. Флуоресцентные зонды могут быть либо плазмидами / fosmids или BACs, меченные флуоресцентными dUTPs, используемый здесь, и описаны в Chaumeil и др., 8. В качестве альтернативы, флуоресцентно меченых олигонуклеотидов могут быть использованы 19. Поскольку ДНК-рыба не требует прядей специфичности, олигонуклеотидные зонды могут быть предназначены для решения любой из двух комплементарных нитей в целевой области. Разветвленные ДНК – зонды, где усиление сигнала достигается за счет двух последовательных раундов специфических и усилителя зондов также могут быть использованы для повышения отношения сигнал-шум рыбы сигналов 20. В качестве альтернативы, РНК-зонды, такие как рибонуклеотидными зондами могут быть использованы, хотя в наших ДНК-зондов на основе гарантировать лучшее компромисс между качеством сигнала, специфичности и простоты использования.
И, наконец, 3D-изображение acquisitiна имеет важное значение для того, чтобы получить требуемую пространственную информацию в этих крупных клеток, и может быть выполнена с использованием различных флуоресцентных микроскопов, таких как микроскоп Apotome или эпифлуоресцентной микроскопов с деконволюции, такими как DeltaVision (GEH), или другие микроскопов подходит для формирования изображения срезов тканей, а также большой (> 20 мкм) ТГК. Следует отметить, что для отдельных локусов ДНК-копии, то точечное сигнал обнаружен зарождающейся РНК рыба или ДНК может не быть легко обнаружены с помощью конфокальной микроскопии.
В заключение отметим, что методы, которые мы описываем здесь должны быть полезны как для детального анализа TGS в контексте развития, но и в других ситуациях болезни. Многие гены, которые участвуют в развитии и функции ТГК у грызунов законсервированы у грызунов и человека, таких как факторы транскрипции, протеазы и молекул клеточной адгезии 21. Мыши являются ТГК модели клеток для изучения генов, которые регулируют развитие плацентарной А.Н.d поэтому дать понимание плацентарных заболеваний человека. Кроме того, из-за того, что эти клетки endoreplicating и поскольку некоторые раковые клетки занимаются программы endocycle, в дополнение к процессам амплификации генов, методы мы описываем также должны быть полезны в единичных исследованиях клеток, необходимых для изучения механизмов, приводящих к нестабильность генома в раковых клетках ,
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Софи Gournet за помощь с иллюстрациями, Джули Chaumeil за чтение рукописи, жилищный центр животных и платформы визуализации агрегата. Эта работа получила поддержку в рамках программы «Investissements d'Avenir» запущен правительством Франции и осуществляется ANR со ссылками ANR-10-LabX-0044 и ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, то EpiGeneSys FP7 нет. 257082 Сеть передового опыта в EH, ERC Advanced Следователь наградит нет. не 250367 и ЕС FP7 SYBOSS предоставляют нет. 242129 в EH Авторы хотели бы отметить клеточной и тканевой визуализации Платформа генетики и развивающего отдела биологии (UMR3215 / U934) из Института Кюри, член France-биоимиджинга (ANR-10-InSb-04), за помощью света микроскопия.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18×18 | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22×22 | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20°C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
Referenzen
- Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
- Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
- Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
- Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
- El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
- Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
- Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
- Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
- Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
- Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture – characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, 4-9 (2008).
- Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
- Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
- Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
- Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
- Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
- Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).
