Generation af induceret pluripotente stamceller fra human melanoma Tumor-infiltrerende lymfocytter
Summary
The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Abstract
Adoptiv overførsel af ex vivo ekspanderede autologe tumor-infiltrerende lymfocytter (tils) kan formidle holdbare og komplette responser i betydelige delmængder af patienter med metastatisk melanom. Største hindringer ved denne tilgang er nedsat levedygtighed af overførte T-celler, forårsaget af telomer afkortning, og det begrænsede antal TIL'er opnået fra patienter. Mindre-differentierede T-celler med lange telomerer ville være en ideel T-celle delmængde til adoptiv T-celle terapi, men at generere mange disse ugunstigt differentierede T-celler er problematisk. Denne begrænsning af adoptiv T-celle terapi kan teoretisk overvindes ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs), der selv-forny, vedligeholde pluripotens, har aflange telomerer, og giver en ubegrænset kilde til autologe T-celler til immunterapi. Her præsenterer vi en protokol til at generere iPSCs bruger Sendaivirusvektorer for transduktion af omprogrammering faktorer i TIL'er. Denne protokol genererers fuldt omprogrammeres, vektor-fri kloner. Disse TIL-afledte iPSCs kan være i stand til at generere mindre differentierede patientår og tumor-specifikke T-celler til adoptiv T-celle terapi.
Introduction
Cellular omprogrammering teknologi, der tillader generering af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) via overekspression af et defineret sæt af transkriptionsfaktorer lover godt inden for cellebaserede behandlingsformer 1,2. Disse iPSCs udviser transkriptionelle og epigenetiske egenskaber og har kapacitet til selv-fornyelse og pluripotens lighed med embryonale stamceller (EKSF) 3-5. Bemærkelsesværdig fremskridt i omprogrammering teknologi i det seneste årti har givet os mulighed for at generere menneskelige iPSCs selv fra terminalt differentierede celler, såsom T-celler 6-8. T-celle-afledte iPSCs (TiPSCs) bevarer den samme omlejrede konfiguration af T-cellereceptor (TCR) kædegener som de oprindelige T-celler, som tillader regenerering af antigenspecifikke T-celler fra TiPSCs 9-11.
Næsten 80% af melanom-infiltrerende lymfocytter (TIL'er) opnået fra en patients tumor specifikt genkender tumor-associerede antigener and opretholde cytotoksicitet over de oprindelige cancerceller 12. Især blev ekspressionen af programmeret celledød protein-1 (PD-1) på TIL'er fundet at identificere den autologe tumor-reaktive repertoire, herunder muteret neoantigen-specifikke CD8 + lymfocytter 13. Adoptiv overførsel af ex vivo ekspanderede autologe TIL'er i kombination med præparative lymphodepleting regimer og systemisk indgivelse af interleukin-2 (IL-2) kan forårsage væsentlig regression af metastatisk melanom i undergrupper af patienter 14. Trods opmuntrende resultater i prækliniske modeller og hos patienter, dårlig overlevelse infunderes T-celler og eksistensen af immunsuppressive veje synes at kompromittere det fulde potentiale af adoptiv T-celle terapi. Aktuelle kliniske protokoller kræver omfattende ex vivo manipulation af autologe T-celler for at opnå store tal. Dette resulterer i genereringen af terminalt differentierede T-celler, der har ringe overlevelse, reduceret Proliferative kapacitet, og høje niveauer af PD-1 15.
Denne begrænsning af adoptiv T-celle terapi kan teoretisk overvindes ved hjælp iPSCs, der kan give en ubegrænset kilde til autologe T-celler til immunterapi. Vi har for nylig rapporteret omprogrammering af melanom TIL'er udtrykker høje niveauer af PD-1 af Sendai-virus (SeV) -medieret transduktion af de fire transkriptionsfaktorer, OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-MYC 16. Mens retrovirus vektorer kræver integration i værten kromosomer til at udtrykke omprogrammering gener, SeV vektorer er ikke-integrere og til sidst slået ud cytoplasmaet. Omprogrammering effektivitet er langt større med et SeV-system sammenlignet med lentivirus eller retrovirusvektorer 6-8. Endvidere kan SeV specifikt omprogrammere T-celler i mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er), mens nogle IPSC kloner dannet af lentivirus eller retrovirusvektorer kan være fra ikke-lymfoide cellelinier 6-8. Her har vi detaljeprocedurerne gennemført til isolering og aktivering af human melanoma TIL'er og til generering af TIL-afledte iPSCs bruger SeV omprogrammering system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her demonstrerede vi en protokol for omprogrammering melanom TIL'er til iPSCs af SeV-medieret transduktion af de fire transkriptionsfaktorer OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-myc. Denne fremgangsmåde, ved anvendelse af et SeV-system at omprogrammere T-celler, har den fordel, en ikke-integrerende fremgangsmåde 7.
En tidligere undersøgelse viste, at en SeV omprogrammering systemet var meget effektiv og pålidelig at omprogrammere ikke kun fibroblaster men også perifert blod T-celle…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
Materials
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
| ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |
Referenzen
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
