Extraction et analyse des acides gras des phospholipides microbiens dans les sols
Summary
les acides gras phospholipides fournissent des informations sur la structure des communautés microbiennes du sol. Nous présentons des procédés pour l'extraction d'échantillons de sol avec un mélange à une seule phase de chloroforme, le fractionnement des lipides extraits en utilisant des colonnes d'extraction en phase solide et méthanolyse pour produire des esters méthyliques d'acides gras, qui sont analysées par chromatographie en phase gazeuse capillaire.
Abstract
les acides gras des phospholipides (AGPL) sont des éléments clés des membranes cellulaires microbiennes. L'analyse des AGPL extraites des sols peut fournir des informations sur la structure globale des communautés microbiennes terrestres. PLFA profilage a été largement utilisé dans une variété d'écosystèmes comme un indice biologique de la qualité globale du sol, et comme un indicateur quantitatif de la réponse du sol à la gestion et d'autres facteurs de stress environnementaux terre.
La méthode standard présentée ici décrit quatre étapes clés: 1. l'extraction des lipides à partir d'échantillons de sol avec un mélange de chloroforme monophasé, 2. fractionnement en utilisant des colonnes d'extraction en phase solide pour isoler les phospholipides d'autres lipides extraits, 3. méthanolyse des phospholipides pour produire l'acide gras esters méthyliques (FAME), et 4. L'analyse FAME par chromatographie en phase gazeuse capillaire en utilisant un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID). Deux normes sont utilisées, y compris le 1,2-dinonadecanoyl- sn – glycéro-3-phosphocholine (PC (19:0/19: 0)) pour évaluer le recouvrement global du procédé d'extraction, et le décanoate de méthyle (MeC10: 0) comme étalon interne (ISTD) pour l'analyse par GC.
Introduction
Les acides gras de phospholipides (de AGPL) font partie des membranes cellulaires microbiennes des domaines bactéries et eucaryotes. AGPL microorganismes produisent de différentes longueurs de chaîne et de la composition en tant que moyen pour maintenir l'intégrité de la membrane cellulaire et la fonction cellulaire en réponse à des conditions d'environnement immédiat; par conséquent, on peut affirmer que les communautés microbiennes qui sont séparées géographiquement, mais sont soumis à des conditions de sol similaires expriment AGPL similaires. AGPL de sol avec une longueur de chaîne entre 14 et 20 atomes de carbone sont généralement considérés comme étant d'origine bactérienne et fongique principalement 1. Dans les cultures mixtes, l'analyse PLFA ne peut pas être utilisé pour identifier les espèces microbiennes individuelles, mais il peut fournir une empreinte globale des communautés microbiennes trouvées dans les sols. En outre, depuis AGPL sont rapidement dégradées lors de la mort cellulaire, ils peuvent être considérés comme représentatifs de la communauté microbienne du sol viable 2. Cette technique a été largement utilisée pour caractériser la composition structurelle des communautés microbiennes trouvées dans une large gamme d'environnements, allant des forêts 3-4 à 5-6 prairies et les champs agricoles 7. Elle a été appliquée avec succès pour caractériser la réponse du sol à la terre des changements de gestion, y compris les forêts claires de coupe 8, chaulage 9, remise en état 10-12, ainsi que des troubles tels que le feu 13, la contamination par les métaux 14 et des hydrocarbures 15, et à l' apparition d' insectes 16 .
La méthode analytique PLFA contemporaine a évolué au cours des six dernières décennies, grâce à plusieurs avancées clés par un certain nombre de groupes de recherche. En 1958, une amélioration significative est née de l' ajustement du chloroforme: methanol: eau dans le rapport de la solution d'extraction pour déplacer le mélange d'un monophasique à un système diphasique 17. Cette extraction lipidique optimisée et le pro d'isolement révisétocol est devenu connu comme la méthode de Bligh et Dyer. Le protocole a été adopté par de nombreux laboratoires au cours des prochaines décennies et, pendant ce temps, White et ses collègues ont contribué à des avancées significatives de la méthode; par exemple, ils ont amélioré l'étape d'extraction par échange d'un tampon phosphate pour l'eau, et ils ont optimisé l'analyse par chromatographie en phase gazeuse (GC) grâce à une meilleure identification des pics et la quantification. Peut-être plus pertinentes à la science du sol, ils ont déterminé en 1979 que les lipides extraits pourraient être utilisés comme un indice de la structure microbienne quand ils ont examiné la biomasse microbienne des sédiments marins 18.
D' autres développements ont eu lieu dans les années 1980 que la méthode est devenue plus largement utilisé dans la science du sol, en particulier par rapport à la rhizosphère 19. A cette époque, le procédé comprend nonadecanoate de méthyle (MeC19: 0) comme étalon interne et 19 l'utilisation d'une colonne d'acide silicique pour le fractionnement des lipides 21 </ Sup>. Après son travail avec Blanc 19,21, Tunlid retourna en Suède et a commencé la recherche en collaboration avec Bååth et Frostegård. En examinant l'efficacité des différents tampons d'extraction pour une série de sols variant la teneur en matière organique, le groupe a montré que le tampon citrate a augmenté la quantité de phosphate de lipides extraits par rapport au tampon phosphate 22. En outre, leur publication 23 sur l'influence du chaulage sur les communautés microbiennes du sol 1993 est devenu un classique de citation en biologie du sol et biochimie 24. Les chercheurs ont utilisés analyse des composantes principales dans le traitement de leurs données. analyse PLFA, comme la méthode est maintenant appelée, génère de grands ensembles de données et l'utilisation des procédures statistiques multivariées pour traiter ces données était très novateur pour l'époque et une source d'inspiration pour beaucoup. En même temps le travail se fait en Suède, des modifications à la procédure PLFA ont été étudiés dansAllemagne par Zelles et ses collègues 25-26. Leur version de la procédure a été marquée par son utilisation d'une colonne (SPE) d'extraction en phase solide au lieu de la colonne d'acide silicique, mais, dans l'ensemble, était plus intensive en laboratoire.
Le document de Frostegård 23, ainsi que la méthodologie détaillée par White & Ringelberg 27, a jeté les bases d'une explosion dans l'utilisation de la technique PLFA pour enquêter sur des questions fondamentales de la science du sol. Depuis lors, d' autres améliorations de la méthode par Firestone et ses collègues ont inclus l' ajout d' une norme GC interne (C10: 0) et C19: 0 en tant que norme de substitution pour améliorer la quantification 28, et remplacer l'utilisation de décanter entonnoirs pour les flacons à fond rond pour simplifier extraction 29. Plus récemment, Chowdhury et Dick 30 ont étudié l'étape de méthylation et ont rapporté que des deux procédures de méthylation utilisés dans la littérature de science du sol la méthode KOH / MeOH identified un plus grand nombre d'acides gras.
La méthode présentée est en grande partie basée sur la méthode originale développée par Bligh et Dyer, et intègre les modifications mentionnées ci-dessus, tels que l'utilisation de KOH méthanolique pour l'étape de méthylation. Deux étalons sont utilisés pour chaque échantillon: une norme de substitution de 1,2-sn – glycéro dinonadecanoyl–3-phosphocholine (PC (19: 0/19: 0)), qui est ajoutée à l'échantillon de sol avant la première extraction pour évaluer l'efficacité et la récupération de l'ensemble du protocole, et à un niveau d'instrument de décanoate de méthyle (MeC10: 0), qui est ajoutée avant l'identification et la quantification par CG.
Nous reconnaissons que la méthode PLFA est couramment utilisé par de nombreux laboratoires d'écologie microbienne dans le monde entier, et a été documentée à plusieurs reprises, y compris par l'Organisation internationale de normalisation 2. L'objectif de cet article est de présenter un facile à suivre et robuste protocole qui peut être utile dans le solles scientifiques qui tentent d'apprendre la technique PLFA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour réduire au minimum et éviter toute interprétation erronée des données AGPL, le dépistage des données attention doit être fait parce que certains AGPL qui se trouvent dans la communauté microbienne du sol sont également présents dans les organismes eucaryotes simples et multicellulaires, tels que les racines des plantes, les algues et les animaux du sol. En outre, les Archaea ne contiennent pas AGPL; à la place, les membranes archées sont composées de lipides éther phospholipides (de PLELs). Par conséquent, le protocole PLFA ne peut pas être utilisée pour caractériser les communautés Archaea dans le sol.
Associant AGPL individuelles à des groupes microbiens spécifiques doivent être prises avec prudence (voir la publication 2011 par Frostegård et ses collègues 34 pour une excellente discussion sur certaines des limites de la méthode PLFA). Au lieu de cela, il peut être plus approprié, comme cela a été fait dans la figure 2, à AGPL de groupe en fonction de leur structure chimique, par exemple, i) AGPL saturés à chaîne droite, ii) AGPL saturés de mi-chain (10-méthyl) de ramification, des acides gras saturés iii) terminale ramifiée, iv) les AGPL mono-insaturés, v) AGPL poly-insaturés, et vi) des acides gras hydroxylés.
Poids de l'échantillon peut avoir besoin d'être ajustée en fonction de la quantité de AGPL extractibles contenus dans un échantillon de sol donné. En n'ajustant la quantité de terre extraite dans les sols actifs moins de microbes, les utilisateurs risquent de ne pas obtenir un nombre suffisant de réponses AGPL (pics) pour représenter avec précision la communauté microbienne globale. Dans les sols très microbiologiquement actifs avec des concentrations élevées de AGPL, les utilisateurs sont à risque de surcharger la colonne de GC, ce qui empêche une quantification précise des AGPL. Dans les deux cas, des échantillons de sol doivent être ré-analysés pour AGPL. Un bon point de départ est d'ajouter 0,5 g pour les échantillons de sol organiques (tels que les sols forestiers), et environ 3 g pour les échantillons de sol minéral. Etant donné que la quantité d'extractibles AGPL est généralement corrélée à la quantité de carbone organique contenu dans le sol d'un échantillon nousight peut être ajustée en fonction de la teneur du sol en carbone, par exemple, 1 g de l' échantillon de sol minéral peut être suffisante pour obtenir une bonne quantification PLFA lorsque la teneur en carbone est de 10-15%, tandis que> 5 g peut être nécessaire si la teneur en carbone est ≤ 0,5 %. Il est toujours une bonne idée de faire un essai avec quelques échantillons pour optimiser le poids échantillon avant l'ensemble est exécuté.
stratégies de dépannage communes pour le protocole PLFA et l'analyse GC sont les suivantes. Si la valeur de référence GC chromatogramme est trop élevée, la bouteille de gaz H 2 doit être changé. Si les pics de solvant ou ISTD sont manquants dans le chromatogramme, il pourrait y avoir un problème avec l' injection de l' échantillon (par exemple, une seringue, de problème avec échantillonneur automatique, flacon vide ou manquante, erreur de positionnement du flacon bouché). Si plus de trois pics sont détectés dans la méthode / échantillon à blanc, il y a contamination de l'ébauche, et il y a une forte probabilité que le même contaminant (s) sera présent dans l'échantillon GC chromatograms. Trouver la source de contamination (médias habituellement aqueuse), ou à tout le moins, faire en sorte que les pics correspondant au contaminant sont retirés des chromatogrammes des échantillons et que ces pics ne sont pas inclus dans l'analyse statistique des données AGPL. En outre, il est une bonne idée d'exécuter hexane rinçages entre les échantillons lorsque report est suspectée. Pics supplémentaires dans le rinçage à l'hexane indiquera report (c. -à- composants plus lourds éluant de l' exécution précédente).
Lipids sont particulièrement sensibles à l'oxydation, et un soin particulier doit être exercé tout au long du protocole pour protéger les échantillons de l'air et de la lumière d'exposition, comme les stocker dans l'obscurité et les garder sous azote. Tous les échantillons et les blancs doivent avoir C19 suffisante: 0 norme de substitution. A C19 manquant: 0 pic, soit dans des échantillons ou des flans, indique une mauvaise récupération ou une perte complète d'analytes. Une réponse de C19: 0 dans les échantillons qui est sensiblement inférieur au mflans éthode / l'échantillon indique une perte d'analytes à un moment donné dans la méthodologie PLFA. Lorsqu'ils sont confrontés à une mauvaise C19: 0 récupération, tous les aspects de la procédure doivent être soigneusement examinées et examinés, y compris l'extraction initiale, toutes les étapes de transfert d'échantillons, l'extraction SPE, la méthylation de l'acide gras, le séchage, le stockage et la manipulation échantillon afin d'isoler le ou les étapes où analytes sont perdus. D'autre part, il se peut que l'extraction de certains échantillons de sol peut donner C19: 0, auquel cas la récupération de la norme de substitution peut être surestimée. Tout en utilisant deux normes ((PC (19: 0/19: 0) et MeC10: 0) ne sont pas une exigence absolue, nous avons trouvé cela très utile lorsqu'il est nécessaire de résoudre Tant que le MeC10:. 0 réponse est adéquate , le dépannage peut se concentrer sur les étapes préalables à l'analyse de GC.
Comme indiqué précédemment, la prudence doit être utilisé lors de l'interprétation des relations de signification et de l'écosystème écologique basée uniquement sur les biomarqueurs dériventd à partir des données AGPL, parce que les études de culture pure révèlent que les souches bactériennes isolées contiennent différentes catégories de AGPL. Au lieu de cela, AGPL de biomarqueurs devraient être considérées comme un complément utile dans une suite d'éléments de preuve en faisant des inférences écologiques plus larges. Dans la littérature, AGPL individuels ont été proposés et utilisés comme marqueurs pour différents groupes microbiens. AGPL saturés sont généralement utilisés pour représenter des bactéries Gram-positives et mono-insaturés AGPL sont utilisés pour les bactéries Gram-négatives. biomarqueurs reconnus pour les bactéries gram-négatives comprennent les acides gras mono-insaturés avec l'insaturation au ω5 ou la position ω7, tels que C16: 1ω7, C18: 1ω7 et C18: 1ω5. En outre, les acides gras cyclopropyle peuvent également être représentatives de bactéries Gram-négatives 35. Par conséquent, AGPL de bactéries gram-négatives peuvent être calculées comme étant égale à la somme de A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. biomarqueurs reconnus pour les bactéries gram-positives sont en phase terminale ramifiées saacides gras turated, iso-ramifié tel que C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; ou antéiso-ramifiés, tels que C15 et C17 0a: 0a. Saturés AGPL avec milieu de chaîne (10-méthyl) ramification, comme 10Me16: 0 et 10Me18: 0 sont typiquement présents dans les actinomycètes 36. Ainsi, AGPL à partir de bactéries Gram-positives peuvent être calculées comme étant égale à la somme de A 0 (ISO, Anteiso, 10-méthyle).
De nombreux biomarqueurs associés à des champignons PLFA sont souvent polyinsaturés, mais certains biomarqueurs fongiques sont monoinsaturés. Par exemple, en termes de biomarqueurs monoinsaturés fongiques, C16: 1ω5 a été identifié comme un indicateur des champignons mycorhiziens arbusculaires (AMF) 37, C18: 1ω9 est commun dans les champignons saprophytes et ectomycorhizes contiennent généralement C16: 1ω9. La présence de di-insaturés en C18: 2ω6,9 se produit souvent en conjonction avec C18: 1ω9 et corrèle également bien avec l'ergostérol fongique stérol, ce qui indique que C18: 2ω6,9 peut représenter de façon adéquate ectomycorrhizae et champignons saprophytes 38. Le tri-insaturé C18: 3ω 6,9,12 a également été utilisé comme un biomarqueur pour les champignons 10; cependant, C18: 3ω6c peut être trouvée dans d'autres organismes eucaryotes, y compris les plantes et les algues, bien qu'il soit généralement pas trouvé dans les bactéries. En terme de protistes du sol, C20: 4ω6c a été reconnu comme un biomarqueur de protistes 39, bien que, d' autres travaux a échoué à détecter C20: 4ω6c même lorsque les populations de protistes viables ont été confirmées visuellement en utilisant la microscopie optique 40.
De nombreuses études portent sur des questions écologiques liées à la communauté globale microbienne du sol en utilisant des techniques d'ordination multivariées comme un outil d'analyse de données PLFA. Lors de l' utilisation de cette approche, certains auteurs ont choisi d'exclure AGPL rares de l'ensemble de données en supprimant les AGPL qui sont présentes dans moins de 5% des échantillons 4. Les acides gras saturés normaux C16: 0 et C18: 0 sont abondants dans tous les micro-organismes du sol, y compris les procaryotes et les EUKaryotes. Par conséquent, certains chercheurs choisissent de supprimer ces AGPL avant l'analyse statistique sur la base qu'ils peuvent ne pas être des indicateurs sensibles de la composition de la communauté microbienne du sol – bien que C16: 0 et C18: 0 sont encore à être inclus lorsque additionnant tous les AGPL pour un indice de la biomasse microbienne. En terme d'analyses statistiques, de nombreux chercheurs choisissent de mener une analyse multidimensionnelle (SNDM) coordination non-métrique car cette technique est bien adaptée aux données qui peuvent ne pas être normalement distribué 33. Des analyses supplémentaires liées à des variables catégoriques peuvent inclure l'analyse des espèces indicatrices, qui peuvent se rapporter l'occurrence de AGPL spécifiques aux groupes catégoriques et les procédures de réponse de permutation multiples (PPRM), qui peut aider à déterminer les similitudes ou les différences entre les communautés microbiennes assignées à des groupes catégoriques. En outre, les arbres de régression multivariée (MRT) peuvent être particulièrement utiles lorsque l'influence de plusieurs variables expérimentales oules traitements doivent être évalués en tant que variables explicatives potentielles de 5 (par exemple, la texture du sol, l' humidité, l' âge de la remise en état).
Une fois établi, le protocole PLFA est une méthode d'analyse relativement simple qui peut être très utile lors de la quantification réponse microbienne du sol aux changements environnementaux et les perturbations anthropiques. Bien que les techniques moléculaires telles que les empreintes génétiques sont mieux adaptés à la caractérisation détaillée des communautés microbiennes, la méthode PLFA présente l'avantage de fournir des informations quantitatives sur la biomasse microbienne totale 34. Dans notre laboratoire de recherche, une personne peut confortablement traiter un ensemble de 20 échantillons de plus de 4 jours, et nous avons trouvé le protocole présenté ici pour être une technique robuste et reproductible pour évaluer la qualité biologique du sol.
La puissance de la méthode PLFA peut être considérablement étendu en le couplant à analyse des isotopes stables 41, 42. Plus précisément, outre of 13 substrats C marqué sur les sols permet la quantification de substrat incorporation dans les microorganismes du sol si l' analyse isotopique des AGPL individuels 41. En outre, cette méthode semble être un outil très prometteur pour élucider les liens trophiques dans les aliments du sol 42 toiles.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.
Materials
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter – Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µL gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection – 2 bags required per sample collected |
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