提取及土壤微生物磷脂脂肪酸分析

注：请始终确保正确的个人防护装备（PPE）戴在整个协议。玻璃器皿应该不能用手触摸。从手指，头发，油脂，油和烃脂质是所有潜在的污染物。处理干净的玻璃器皿时，请务必戴上丁腈手套和冲洗手套用70％酒精。 1.玻璃器皿的研制分析 一次性玻璃器皿（ 例如 ，离心管） 在450ºC包裹在铝箔和热在马弗炉四个半小时。 聚四氟乙烯（PTFE）-lined帽 泡帽在磷酸盐洗涤剂一小时，然后用刷子刷洗洗热水和磷酸盐洗涤剂。冲洗掉自来水肥皂。 在酸浴的地方（5％HCl）的一小时只（不离开不再作为衬里可能会掉下来，如果他们浸泡时间过长的上限。冲洗三次在自来水中。冲洗在蒸馏水三次。干在40ºC烤箱。 可重复使用的玻璃器皿（ 例如 ，将10毫升，15毫升45 mL样品瓶/罐） 在热水和磷酸盐洗涤剂擦洗刷洗。冲洗掉用自来水和发生在酸浴（5％HCl）的过夜皂。在自来水中冲洗三次，然后在40ºC漂洗在蒸馏水洗涤三次，然后干燥烘箱中。 在干净的铝箔包（50毫升罐子单独包装和其他玻璃器皿被包裹在样品批次， 例如 ，20），并在马弗炉中的热在450ºC四个半小时。 容积玻璃器皿（ 例如 ，容量瓶） 在热水和磷酸盐洗涤剂擦洗刷洗。冲洗掉用自来水和发生在酸浴（5％HCl）的过夜皂。在自来水中冲洗三次，用蒸馏水漂洗三次，然后在烘箱中在40℃干＃186℃。 使用前用少量溶剂（ 如甲醇）冲洗3次-不要把容量瓶在马弗炉。 2.收集和土壤样品处理之前PLFA分析收集的土壤样品进入无菌袋，并且除非这些可立即进行分析，尽快冷冻。在冷冻室（-80℃），直到准备商店样品进行的样品冷冻干燥。冷冻后的冷冻干燥机的指示样品的干批次。 每个冻干样品转移到新标记的无菌袋。从冻干材料称出样品中包入了磷脂脂肪酸萃取预标记的低沉的离心管中。 注：一般原则是把0.5克的有机材料（碳含量> 17％的重量）和高达3.0克矿物的土壤样品。记录样品的重量每个样本。 对于每10个样品，也掂量出一个额外重复进行分析，并为每20个样本包括一个空白（ 即 ，不具有任何样品离心管-用作对照，以确定在磷脂脂肪酸提取过程中的任何潜在的污染）。同时样品管的过程批次。 注意：一组20个样本将对应于一个批次23样品管（样品1至10，样品10的一个重复，样品12至22，样品22的一个重复，和一个空白=批次23样品管）。 注：为他们准备GC分析和运行它们放在一起之前进行萃取，再经分离，然后甲基化样品批次。这有助于确定是否有什么差错的地方失误发生，并可能有助于降低必要，请重复提取的数目。 3. PLFA技术（步骤针对个别样品，但完整的一整批一次） 注：步骤描述的PLFA技术的所有步骤1-3下面应在通风橱中使用适当的PPE和以下实验室安全原则进行。 提取（步骤1）： 通过溶解在50毫升14克KOH蒸馏水，去离子水（DH 2 O） 的制备5.0微米的KOH。 通过在400ml的dh 2 O溶解31.52克柠檬酸一水合物制备的0.15M柠檬酸盐缓冲液调节pH至4.00±0.02，加入5.0米KOH;大约45-50毫升5.0微米的KOH将需要将pH调节至4.00。当pH调节，用容量瓶稀释柠檬酸缓冲到1000毫升在冰箱在不使用时（长达一个月）存储柠檬酸盐缓冲液。 每日准备在PC（19：0/19：0）nonadecanoate替代标准稀释250μl的在25毫升氯仿的储备溶液（10毫克/毫升）的（这提供了一批23个样品足够替代标准）。添加0.5的PC毫升（19：0/19：0）替代标准溶液的样品离心管中。 一个DD的布莱和代尔萃取到土壤样品中的顺序如下：ⅰ）2.0毫升柠檬酸盐缓冲液，ⅱ）2.5毫升氯仿，以及iii）5.0毫升甲醇。用30秒的PTFE内衬帽和旋涡帽样品;放置在最终过端振动器2小时。 离心机226 XG与帽15分钟。绘制上清液断用巴氏吸管，并转移到经标记45毫升玻璃管形瓶中。 第二轮的Bligh和Dyer的萃取剂添加到每个样品中，并重复上述步骤4和5。绘制上清液断用巴氏吸管并转移到同一标记45毫升玻璃管形瓶中。 添加到标记的含上清液45毫升玻璃小瓶：ⅰ）5.0毫升氯仿，以及ii）5.0毫升柠檬酸盐缓冲液。盖有白色聚四氟乙烯衬盖，涡旋玻璃小瓶30秒。让它在黑暗中室温下放置过夜（避免氧化）。 小心真空断45的管瓶中的上层水相（如果没有真空可用，吸移管应通过aque降​​低OU的阶段非常仔细地为吹打有机相时不收取任何的吸管）。吸取下层有机相为标记15毫升小瓶。 下被压缩的 N 2（以避免氧化）在室温下将15ml小瓶地方批次。蒸发氯仿关闭缓慢，设置的 N 2流中的液体的表面皱褶在小瓶但不爬小瓶的侧面。 拧上在冷冻聚四氟乙烯内衬帽和存储样品在-20 C包裹在铝箔（缠绕分批而不是单独），直到准备与第2步进行。 脂质分馏（步骤2） 将固相萃取柱支架上的玻璃缸套管。插入新的SPE柱（二氧化硅，500毫克，6ml）中插入套管。必要的标签栏（建议，以避免混淆样本）。 通过加入5毫升丙酮中，并让它漏极通过调节每一列，然后添加5毫升氯仿两个加法（总体积= 10毫升）中。允许第二氯仿洗流出熔块，直到约1毫米的位置，然后关闭水龙头。 通过加入0.5毫升氯仿轻轻小瓶和涡流重新溶解样品（存储在第1步的端部15的管瓶中）。转移再溶解样品使用巴氏吸管在SPE柱;重复总共2转移（每个样品1毫升氯仿总传送量）。 直接铺设脂质样品到塔的中心，并允许溶剂完全排入油箱。 通过加入5毫升氯仿中，以每列洗脱中性脂质。允许溶剂完全排出到油箱。 通过加入5毫升丙酮的每一列洗脱糖脂。允许溶剂完全排入收集箱。 删除列从罐站，并与真空装置排水槽。插入机架干净，标离心管进入水箱。更换色谱柱站在坦克;上面标有列应该排队，标CENTR下面ifuge管。 加入5毫升甲醇到每个列洗脱磷脂到离心管中。等待固相萃取柱他们处理之前在通风柜干燥。在室温下被压缩的 N 2干燥向下磷脂部分。 用N 2.在冰箱内衬PTFE帽并确保样品螺杆清洗管在-20ºC铝箔包裹（套分批而不是单独），直到准备进行第3步。 脂质甲基（步骤3）。 打开设置为37ºC热水浴。通过使用的1000ml容量瓶中溶解57.1毫升冰醋酸1,000ml中的dh 2 O制备1M乙酸（如果尚未制造）。这种溶液可在室温下储存长达三个月。 。 准备一批甲醇氢氧化钾。通过在40ml甲醇0.45克KOH溶解制备的0.2M KOH溶液。根据调整的KOH体积和甲醇nticipated批量大小在步骤3中的日常准备这个解决方案;不存储更长的时间。 从冰箱中取出样品（步骤2之后存储的离心管中），并允许样品来室温。加入0.5毫升氯仿和0.5毫升甲醇到每个样品中，随后加入1.0ml的KOH甲醇。盖管紧密地与聚四氟乙烯衬盖。涡流混合。 放置密封样品在37ºC浴中30分钟。确保水水平是最小的1-2毫米的样品液体水平之上。删除并允许样品冷却。虽然样本在水中洗澡，用的标签样品ID（10毫升玻璃小瓶聚四氟乙烯衬里帽）的小玻璃瓶中。 加入2.0毫升己烷至每个样品并乱舞。然后0.2毫升1.0M的乙酸添加到每个样品和漩涡再次混合;相分离应该变得可见。 加入2.0毫升的卫生署2 O的每个样品突破阶段。涡旋样品30秒。然后在226×g离心2分钟离心样品。 运用总之巴斯德吸管，转移前阶段清理标记10毫升小瓶。要小心，不要转移任何下层（水）相。 加入2.0毫升己烷向每个样品的离心管并乱舞。涡旋样品30秒。然后在226×g离心2分钟离心样品。 使用短巴斯德吸管，顶相再次添加到标记的10ml玻璃管形瓶中。 下的 N 2蒸发在室温下标记10毫升玻璃小瓶中的溶剂。拧上在冷冻聚四氟乙烯内衬帽和存储样品在-20 C包裹在铝箔（缠绕分批而不是单独），直到准备用GC分析进行。一定要标记所有样本。 气相色谱仪（GC）分析 注意：个别磷脂脂肪酸的鉴定和定量是使用连接到任何一个FID或MS检测器为GC完成。虽然下面的说明是GC-FID，样品制备将为GC-MS有效为WELL。一个例子设置为的GC-FID系统将包括一个25米×0.2毫米×0.33微米（5％ – 苯基）具有以下温度协议 – 甲基聚硅氧烷柱：初始温度190ºC，斜坡10℃/分钟至285ºC ，持有9.5分，斜坡60ºC/分钟至310ºC，持有0.42 31分钟。 加入MeC10一滴准备GC内标（ISTD）：0（甲基癸）至100毫升正己烷（记录续重0.1毫克）。打开气体GC，然后打开GC。确保H 2，N 2和空气气缸是开放的，即有足够的气体来运行分析（H 2不应该得到低于500磅）。 检查一个良好校准的条件，通过运行包含的脂肪酸的混合物，接着己烷空白校准标准得到满足。个别脂肪酸的标识可以手动分配基于标准得到保留时间比较，或者这可能是AUTOMATICA使用可商购的软件31 LLY分配。在所有的情况下，明确地识别可使用的MS检测器2来实现。 注意：一个好的校准的其他症状包括平面基准和正己烷清洗没有污染。 溶解各磷脂脂肪酸样品残余物中加入150μl内标溶液（由脂质甲基步骤3在10毫升玻璃小瓶中含有），并转移到GC小瓶中（可选地使用50到75微升，如果样本响应预期要弱，如在非常沙质土壤）。 设置样品注射体积为2微升。将FID温度300ºC。运行使用250ºC的入口温度的样品中，用H 2作为载气（流速1.3毫升/分钟）和30分流比：1。