Эмбрион Микроинъекция и электропорации в хордовых<em> Ciona интестиналис</em
Summary
Мы представляем переходную трансгенеза и ген нокдаун в Ciona интестиналис, в хордовых сестра группы к позвоночным, используя микроинъекции и электропорации техники. Такие методы облегчают функциональной геномики в этом простом беспозвоночного, который показывает рудиментарные характеристики позвоночных, в том числе хорды и головной сенсорном эпителии и многие ортологах болезней, связанных генов человека.
Abstract
Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.
Introduction
В последнее время, последовательность генома и расшифрованные репертуары генов стали доступны в ряде модельных организмов. Определение генов функциональных связей, однако, и как эти соединения зашито в ДНК для выполнения транскрипционной активности на протяжении эмбрионального времени и пространстве, остается серьезной проблемой, особенно у позвоночных. Сложность регуляторных взаимодействий и сложность геномов 1,2, в частности , у позвоночных, замедлить эффективные функциональный анализ, в частности , на уровне ДНК в естественных условиях. Действительно, ни GRN в настоящее время не анализируется от оплодотворения до конечной, неизлечимо дифференцированной состояния развивающегося организма.
Асцидия C. интестиналис представляет собой модель организма , где такой полный GRN анализ может оказаться невозможным. Он имеет неповторяющихся геном типичный беспозвоночных с небольшим количеством избыточности гена. Позвоночные, в отличие от подверглись два раунда генома дупликации, что ВГАе генерируются большие семейства генов и функциональной диверсификации, но и избыточность между паралогов. Компактные цис – -regulatory последовательности (блоки управления GRNs) С. интестиналис и неизменный эмбриональных родословная с несколькими клетками напоминают C. Элеганс. Кроме того, его уникальное филогенетическое положение как беспозвоночным сестра группы позвоночных в хордовых позволяет наблюдать с развитием, на клеточном резолюции плана тела формирования хордовых 3-6.
Ключевой вопрос , который гарантирует будущий успех функциональной геномики в модельных организмах является генерация большого количества эмбрионов для количественных возмущений в естественных условиях. Развитие техники микроинъекции в Ciona яйца 7, а также возможность быстро получить много скоротечно трансгенных животных с помощью электропорации в естественных условиях в сотни Ciona зиготы 8,9 был прорыв в <em> Ciona функциональной геномики. Здесь мы впервые представляем более трудоемкий метод микроинъекции для ориентации отдельных генов, который остается методом выбора для морфолино (MO) -опосредованного гена нокдаун, в частности материнских транскриптов. MO олигонуклеотиды обычно воздействуют на инициатора ATG или сайты сплайсинга РНК и мешать трансляции белка. Затем мы покажем , как электропорации в оплодотворенных яиц Ciona позволяет для большого количества эмбрионов , которые будут проанализированы в количественном моды, тем самым открывая пути эффективного анализа усилителями в естественных условиях и тканесецифического амплитудно или потерей функциональных подходов, с возможность одновременных манипуляций и анализов. Кроме того , мы продемонстрировать , как Ciona сообщества инструменты используются для в силикомарганца прогнозирования регуляторных областей и эффективного клонирования полных открытых рамок считывания (ORFs) в экспрессирующих векторах. Наконец, мы покажем, дифференциальные субклеточных локализаций флуоресцентно меченыйили меченых белков при избыточной экспрессии с помощью электропорации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существуют две основные методы для создания трансгенных эмбрионов Ciona: микроинъекции РНК или ДНК , и электропорации ДНК. Эти методы генной возмущения в Ciona эмбрионов были впервые использованы в 1990 – х годах 7,8 и с тех пор последовательно улучшилось, и в настоящее время используется в Ciona (и других асцидии родов) 20 во всем мире.
Критические шаги в протоколе
Успешное трансгенез в Ciona гамет, которые легко собраны из взрослых животных зависит от ряда критических факторов. Качество гамет зависит от сезона нереста (как правило, с мая по декабрь в Северной Атлантике, меняется с температурой воды и оксигенации), на качество морской воды в аквариумах (при правильной солености, взрослые остаются здоровыми в течение 2-4 недель) и, наконец, на правильном обращении с гамет после извлечения из взрослых, как описано ниже для различных этапов вПротокол.
Во время этапов подготовки, инкубирование пипетки Пастера с водопроводной водой предотвратит эмбрионов от прилипания и морской воды Прединкубационная агарозы покрытием чашки Петри удалит токсичные вещества, выделяющиеся из агарозы. Как правило, блюда могут быть приготовлены до 2-х недель перед использованием, хранят при температуре 4 ° С, чтобы избежать роста бактерий и ополаскивают свеже перед использованием. Однажды старый, небольшие блюда, кажется, лучше всего подходит для инъекций.
Эффективность и продолжительность dechorionation является важным шагом в протоколе в качестве длительного лечения яиц / эмбрионов будет вредить развитию. Тщательная подготовка (без встряхивание) и правильное хранение (при 4 ° С в течение одной недели) сохранить качество раствора dechorionation. Протеаз в растворе теряют эффективность, если либо смешано слишком сильно при подготовке или в течение долгого времени, особенно при хранении при комнатной температуре в течение более длительных часов / дней. Мы оптимизировали этот важный шаг, используя свежий раствор dechorionation удобнополучали из замороженных аликвот 20x маточного раствора.
Правильная обработка хрупких dechorionated яиц / эмбрионов имеет важное значение и механические ножницы или колющие эмбрионов в то время как пипеткой будет иметь пагубные последствия. Когда пипеткой, эмбрионы сохраняются в максимально возможной степени в виде суспензии (осторожно 'дуть' жидкость циркулировать их последующим плавным, но быстро пипеткой), держа стеклянную пипетку в вертикальном, а не горизонтальном положении. Такой уход применяется ко всем шагам пипеток для мытья, взмучивания и перенос яиц / эмбрионов и из труб, кюветах или пластин, до и после фиксации. После фиксации, особое внимание также должны быть приняты для отдельных устройств пипеток для живых эмбрионов по сравнению с фиксированными, чтобы избежать каких-либо токсичности от остатков фиксаторов.
Микроинъекция довольно сложно в Ciona яиц / эмбрионов из – за их небольшого размера и упругости желточной оболочки и критически зависит от оптимизированного размера наконечникаинъекционная игла, идеальный угол впрыска (движение иглы в одну линию, вдоль радиуса яиц) и тонко настроенный, ручной нарушение желточной оболочки (путем всасывания до аспирации для инъекций). Последнее возможно только в том случае пузырьки воздуха полностью исключены из инжекционного трубки, которая содержит минеральное масло для выравнивания давления всасывания / впрыска. Кроме того, самые маленькие кусочки пыли или яичного мусора засорить иглу, и легко избежать чистых условий работы и полоскание шагов для яиц до переноса на литьевой блюдо. После инъекции, передача яиц на свежих блюд позволит избежать токсических эффектов от мертвых эмбрионов не пережив процедуру инъекции.
Исправление проблем
Потенциальные проблемы в процедуре могут быть решены с помощью следующих решений. Низкие показатели оплодотворения могут возникнуть из-за недостаточной активации спермы, низкой чистоты яиц или больших объемов оплодотворения. Используйте freshlу объединяют и менее разводили спермы. Проверьте движение спермы при активации. Мыть яйца с ASWH до оплодотворения, как описано в шаге 4.2. Уменьшение объема воды и уменьшить количество яиц на оплодотворение блюдо / лунку. Проигрышные эмбрионов в ходе стадий процесса можно избежать путем добавления капли раствора dechorionation более эффективно центрифугировать вниз undechorionated яйца / эмбрионов. Dechorionation время должны быть оптимизированы как частично dechorionated яйца не будет осадка и продолжительным dechorionation является токсичным, в результате чего эмбрионы взорваться.
Асинхронный развитие может возникать из остаточной спермы, выделяющейся при вскрытии. Храните яйца партий, отделенные от различных животных, чтобы избежать неконтролируемого перекрестное опыление. Аномальное развитие может иметь различные причины. В начале и в конце сезона, после того, как держать зародыш от разных индивидов, отделенных, могут быть выбраны лучшие пачками. Избегайте возмущающих эмбрионов для10 мин, которые следуют за оплодотворение, чтобы избежать вмешательства в их ooplasmic сегрегации. Убедитесь в том, что эмбрионы не начинают делиться в то же время передается как пипеткой отделяет сестра бластомеров и приводит к частичному эмбрионов. Используйте меньше спермы для dechorionated яиц, чтобы избежать полиспермию. Используйте свежеприготовленные промытые но агарозном блюда. Убедитесь в том, что пипеткой устройство закрепляющий бесплатно. Держите контрольных эмбрионов, которые не были dechorionated и не электропорации, чтобы обнаружить на каком этапе развития был нарушен. Дополнение эмбрионов с помощью антибиотиков, если происходит загрязнение и разложение.
Если устройство впрыска "забиваются" отверстие иглы для инъекций может быть проверена путем вытеснять некоторые из его окрашенного содержания. Засорение материал может быть стерт, осторожно волоча кончик иглы через агарозы. Пузырьки воздуха в инъекционной трубки и / или игла должна быть удалена. Изменение иглы для лучшего контроля объема впрыска, как нээDLE наконечник может сломаться или забивают вдоль инъекции. Полоскание яйца и поместить их в чистом инъекционного блюде, если мусор накапливается в блюдо. Центрифуга раствора для инъекций перед заполнением свежих игл для того, чтобы какие-либо оседают мелкие частицы или кристаллы. Также полезно практикует инъекции только с витальным красителем. Проверьте технику впрыска с помощью подкормки инъекционные и не инъекционные яйца. И, наконец, консультации с опытным коллегой может быть полезным, чтобы улучшить технику инъекции.
Для контроля вне целевых эффектов второй непересекающиеся MO и спасение с модифицированной мРНК , которая не распознается Мос может достоверно исключает неспецифические фенотипические эффекты в Ciona.
Микроинъекция: значение и ограничения
Микроинъекция в Ciona была использована для создания первого план для целого гена эмбрион регуляторной сети (GRN) в хордовых 11. Тем не менее, несмотря на столь Ремаrkable достижение, микроинъекции в Ciona эмбрионов имеет свои ограничения, из – за относительно небольшого размера (0,14 мм в диаметре) из Ciona яиц. По сравнению с таковой других видов хордовых , где чужеродная ДНК / РНК вводится микроинъекций, Ciona яйца сравнительно трудно обрабатывать и скорость инжектированных Ciona эмбрионов на эксперимент остается на низком уровне (в среднем от 30 до 50 эмбрионов на эксперимент), что затрудняет количественный анализ. Тем не менее, для возмущающих материнских факторов в Ciona, микроинъекции ОЧ является методом выбора также для изучения их участия в зиготического начала развития от 16 до 32 клетки на 15 этапах. Кроме того, возможно, хотя гораздо труднее microinject отдельных бластомеров до стадии 16-32 клеток. И, наконец, микроинъекции остается наиболее эффективный метод получения трансгенных эмбрионов (мРНК или инъекции ДНК) в отличных от Ciona видов асцидии, для которых полностью Optimiпротоколы электропорации Zed не существует.
Электропорация: значение и ограничения
Чтобы преодолеть низкие цифры и другие ограничения микроинъекции, большая часть сообщества Ciona использовала электропорации ДНК плазмиды , поскольку она была разработана и опубликована как оптимизированный и стандартизированного протокола Zeller и др. В 2004 году 9. В самом деле, тысячи трансгенных эмбрионов Ciona могут быть сгенерированы в течение одного часа с до 500 эмбрионов одновременно электропорации в одной кювете с использованием одного 50 V импульса 16 мс. Подход генерации огромного числа трансгенных эмбрионов до сих пор уникальной среди хордовых модельных организмов. Это привело Ciona быть быстро признана в качестве мощной модельной системы для выполнения в естественных условиях анализа потенциальных цис -regulatory регионов и сотовой / субклеточных локализации, в качестве примера здесь.
Хотя electroporatiна в Ciona зиготы коренным образом произвели революцию в области исследований хордовых GRN, техника все же сталкивается с некоторыми пределы. Во- первых, плазмиды скоротечно вводят в Ciona эмбрионов и, скорее всего , наследуется как экстрахромосомных массивы, что делает стабильность электропорации ДНК плазмиды спекулятивной. Кроме того, очень сложно, может быть, даже невозможно, контролировать копии электропорации плазмидами, которые будут приняты за каждым зиготы, таким образом, что приводит к фенотипическим колебаний. Еще одна проблема, что делает его трудно интерпретировать результаты электропорации это явление, которое мы называем мозаицизм. Электропорации плазмидная ДНК может быть рассмотрен на различных положениях стадии эмбриона одноклеточного; который определяет, какие и сколько четверти зиготы получит плазмиды быть унаследованы потомками бластомеров. Такие вариации четко делает интерпретацию количественных эффектов более трудным. Тем не менее, большинство проблем, которые приходят с electroporaИзменчивость ции решается путем соответствующего количества биологических образцов, с подсчетом и статистики LacZ (или GFP) положительных клеток, которые легко получить в одном пакете.
Универсальность и потенциал для электропорации генной инженерии
Электропорация в конечном итоге позволяет середине скрининга потенциальных цис -regulatory регионов и количественного анализа функции гена раз клонировали в репортер или плазмид экспрессии. Благодаря компактной Ciona генома, выявление и клонирование потенциальных регионов регуляторных довольно прост 3. Стратегия использования богатства данных сообщества демонстрируется на рисунке 2А. Клонирование репортер и генов плазмид , кодирующих также способствует образованию Ciona адаптированы, GATEWAY совместимые вектор люкс 19 и совместимый полная длина ORF библиотеки 18. Оба инструмента доступны для сообщества ипозволяют эффективно, рестрикционными ферментами свободной рекомбинации регуляторных водителей и кодирующих областей, как показано на фигуре 2В.
В последние годы электропорации был успешно адаптирован для достижения ткани , ориентированных манипуляции генов с плазмидами, экспрессирующими ген инструменты редактирования , такие как компоненты CRISPR / cas9 под контролем ткане – специфических драйверов 21,22. Такие подходы будут быстро продвигаться вперед наше понимание динамики GRNs и потенциально законсервированных сигнальных механизмов, в том числе кодов фактора транскрипции, участвующих в формировании тканей и ступенчатого выхода из плюрипотентности. Кроме того, тканеспецифическая убыт- или усиления из-функции подходов (по CRISPR / cas9 или сверхэкспрессией) с помощью электропорации будет способствовать для изучения Ciona ортологи связанных с заболеванием генов человека. Действительно, каталоги для Ciona ортологах генов болезней человека и их полной длины ORF , кодирующих клонов легко состле для анализа в Ciona 1 8. Из генома широких дупликации позвоночных, большинство человеческих генов обладают функционально избыточных паралоги, усложняющие анализ функции гена 1. Ciona быть более простой системы с типичным расположением хордовых ткани у личинок должны раскрыть основные роли таких важных, часто функционально консервативных генов.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).
Materials
| Lab with constant temp. (~ 18°C) | For embryo work | ||
| Ciona intestinalis adults | UPMC – Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
| KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
| CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
| MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
| MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
| NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
| Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
| Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
| Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
| Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
| Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
| Plastic petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
| Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
| NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
| Tris | Roth | 5429.3 | 1M pH9.5, for sperm activation |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12h |
| Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
| 2ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
| Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
| Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
| Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
| Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
| Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
| X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
| K5Fe(CN)6 | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
| K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
| Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
| Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
| Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
| Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
| Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection |
| Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
| Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
| All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
| Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5mM | |
| Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
| Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
| Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
| Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 |
Referenzen
- Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).
- Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).
- Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).
- Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).
- Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux’s Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).
- Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124 (3), 589-602 (1997).
- Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).
- Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).
- Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).
- Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).
- Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).
- Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
- Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).
- Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).
- Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2 (9), e916 (2007).
- Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).
- Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).
- Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).
