Aggregate Größenoptimierung in Mikrotiterplattenvertiefungen für Abhänge-basierte Herz Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

1. Herstellung von Mediumkomponenten Bereiten Waschmedium. Pro 100 ml DMEM / F12, 1 ml 100x Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep), 1 ml 100x L-Glutamin und 5 ml Serumersatz. Bereiten Sie die chemisch definierte Basal Cardiac Induktionsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die folgenden Stamm Reagenzien für die Medien, die in diesem Protokoll verwendet werden. L-Ascorbinsäure: Bereiten Sie eine Stammlösung von 5 mg pro ml in 4 ° C, steril ultrareinem destilliertem Wasser in einem konischen Rohr. Lassen Sie diese Lösung auf Eis und verwirbeln das Rohr regelmäßig, bis der gelöste Stoff vollständig gelöst ist. Filter-sterilisieren die Ascorbinsäure-Lösung eine 0,22 & mgr; m Spritzenfilter. Vorbereitung 1 ml Aliquots der Ascorbinsäure-Lösung und speichern diese Aliquots bei -20 ° C. Verwenden Sie ein frisch aufgetauten Aliquot jedes Mal Medium hergestellt wird. Am Tag der Medienherstellungs, 13 & mgr; l Monothioglycerin (MTG) in 1 ml Basal Cardiac Induktionsmedium verdünnen. Nicht verwendete, verdünnte MTG. Vorbereitung 1 ml Aliquots von Transferrin (30 mg / ml) bei -20 ° C zu speichern. Store-Aliquots für 3 Monate bei 4 ° C aufgetaut. Herstellung von 4 mM Salzsäure (HCl), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). In einem Abzug, fügen Sie 30 ul 6,0 N HCl-Lösung auf 50 ml ultrareinem destilliertem Wasser. Filter-sterilisieren die Lösung eines 0,22 & mgr; m Spritzenfilter. 2 ml 25% BSA-Lösung zu der Lösung 50 ml HCl. Bereiten Phosphate Buffered Saline (PBS), enthaltend 0,1% BSA. In 20 ul 25% BSA-Lösung pro ml PBS. Bereiten Sie Menschlicher Knochen morphogenetische Protein 4 (BMP-4) Stammlösung (10 ng / ul). Auflösen 10 ug lyophilisierte BMP-4 in 1 ml 4 mM HCl-Pufferlösung, enthaltend 0,1% BSA. Vorbereitung 50 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C zu speichern. Bereiten Menschliche Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (bFGF) Stammlösung(10 ng / ul). Auflösen 10 ug lyophilisierte bFGF in 1 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS), enthaltend 0,1% BSA. Vorbereitung 50 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C zu speichern. Bereiten Menschen Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Stammlösung (5 ng / ul). Man löst 5 ug lyophilisierte VEGF in 1 ml PBS, enthaltend 0,1% BSA. Vorbereitung 50 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C zu speichern. Bereiten Sie Activin A-Stammlösung (10 ng / ul). Auflösen 10 ug lyophilisierte Activin A in 1 ml PBS, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). Vorbereitung 50 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C zu speichern. Bereiten Sie Inhibitor der Wnt-Produktion-2 (IWP-2) Stammlösung (10 mM). Man löst 2 mg IWP-2 in 429 ul Dimethylsulfoxid (DMSO). Herstellung von 10 & mgr; l-Aliquots bei -80 ° C zu speichern. Bereiten Sie die komplette Cardiac Induktionsmedium. Zu 100 ml Basal Cardiac Induktionsmedium 1 ml 100x Pen / Strep, 1 ml 100x L-Glutamin, 500 & mgr; l Transferrin, 1ml frisch Ascorbinsäure aufgetaut, und 300 ul MTG. Nicht verwendete Medium. 2. Herstellung der Mikrotiterplatte HINWEIS: Alle Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden. 0,5 ml Spüllösung (Kit-Komponente) zu jeder Vertiefung, die auf der Platte verwendet werden. Um sicherzustellen, dass die Lösung in Kontakt mit der gesamten Fläche innerhalb jeder Vertiefung, die Platte bei 840 × g für 2 min zentrifugiert. Inkubiere die Platte für 30 bis 60 min bei RT. Absaugen die Spüllösung aus den Brunnen. Waschen Sie sich gut zweimal wie folgt: 1 ml PBS in jede Vertiefung, Zentrifuge die Platte bei 840 × g für 2 min und dann auf die PBS absaugen. 3. Bildung von HPSC Aggregate in der Mikrotiterplatte HINWEIS: Alle Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Legen Waschmedium in einem 37 ° C Wasserbad. HINWEIS: Das benötigte Volumen = 1 ml x Anzahl der Vertiefungen von hPSC, die getrennt werden wird. Distanzieren hPSCs auf einzelne Zellen Hinweis: Diese Schritte beschreiben die Dissoziation von Zellen, die auf 6-Well-Platten – die Reagenzienvolumina für verschiedene Kulturformate proportional skaliert werden kann. Saugen Sie das Kulturmedium aus jeder HPSC Kultur gut für die Dissoziation. Spülen jede Vertiefung mit 1 ml der Dissoziation Enzym, und dann absaugen sofort die Dissoziation Enzym aus jeder Vertiefung. Hinweis: Rest Dissoziation Enzym sollte ausreichend sein, um die Zellen zu distanzieren. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 3 min. 1 ml Waschmedium zu jeder Vertiefung und mechanisch die Zellen aus dem Gewebekulturoberfläche dissoziieren durch Pipettieren des Waschmedium mit einem P1000 Mikropipetter über die Gewebekulturoberfläche. Wenn die Dissoziation erscheint an dieser Stelle unvollständig und Zellklumpen bleiben, passieren die Suspension durch ein Sieb sein. Übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen und zu speicherndas Rohr in dem Inkubator während der Zellzahl wird in dem nächsten Schritt durchgeführt. Führen Sie eine Zellzahl: Nehmen Sie eine 10 ul Probe der Zellsuspension im vorherigen Schritt gesammelt. In 30 ul Trypanblau und gut mischen die Suspension durch Pipettieren. Übertragen Sie 10 ul Trypanblau gefärbten Zellen zu jeder Kammer eines Hämocytometer und zu visualisieren unter dem inversen Mikroskop mit dem 10X-Objektiv. Zählen Sie die Zellen. Aus den Zellzahl ergibt, zu berechnen , wie viele Brunnen können bei 1,2 x 10 6 Zellen pro Vertiefung der Mikrotiterplatte ausgesät werden. Berechnen Aggregation Medium benötigt pro Vertiefung, die Zellen in 1 ml auf Saatgut. Bereiten Sie Aggregations Medium. Pro 10 ml vollständigen Herzinduktionsmedium, 0,5 ul BMP4-Stammlösung (Endkonzentration = 0,5 ng / ml) und Y-27632 ROCK-Inhibitor (Endkonzentration = 10 & mgr; M) hinzufügen. Entfernen Sie die konische Röhrchen, die hPSCs aus dem Inkubator und centrifu enthältge das Rohr bei 200 xg für 5 min. Absaugen Waschmedium und Resuspension der Zellen in Aggregations Medium bei einer Dichte von 1,2 x 10 6 Zellen pro ml. Saugen Sie das PBS-Waschlösung aus jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte. Mit Hilfe eines P1000 Mikropipettierer gleichmäßig verteilen und Samen 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung auf der Mikrotiterplatte. Um eine große Anzahl von Vertiefungen Saatgut, vortexen periodisch die Zellsuspension zu verhindern Einschwingzeit. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 xg für 5 min. Beachten Sie die Platte unter dem Mikroskop zu bestätigen Zellen auf den Boden jeder Vertiefung gesponnen haben. Inkubiere die Platte für 24 Stunden bei 37 ° C in einem 5% CO 2, 5% O 2 (hypoxisch) Inkubator. 4. Herz Induction Phase 1 Einen Tag nach Aggregation (Tag 1), bereiten Sie das erforderliche Volumen von Stufe 1 Induktionsmedium (für eine 24-Well-Platte, Volumen = 1 ml x Anzahl der Wells). Für 1 ml KomplettHerz-Induktionsmedium, fügen 1 ul BMP4-Stammlösung (Endkonzentration = 10 ng / ml), 0,5 ul bFGF-Stammlösung (Endkonzentration = 5 ng / ml) und 0,6 ul Activin A (Endkonzentration = 6 ng / ml). Legen Sie das Medium in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min. Entfernen Sie die Mikrotiterplatte aus dem Inkubator. Überprüfen Sie die Aggregate unter dem Mikroskop. Im Vergleich zum unmittelbar nach der Zentrifuge Aggregation, sollten sie intakt mit glatten Rändern (runder und weniger Platz als am Vortag) erscheinen. Entfernen Sie den Überstand ohne Störung der Aggregate innerhalb der Kavitäten: Halten Sie die Mikrotiterplatte horizontal Ebene (dh., Nicht verkanten). Für jede Vertiefung auf der Mikrotiterplatte, legen Sie die Spitze eines P1000 Mikropipetter an der Oberfläche des Kulturmediums und gegen den Rand des Brunnens. Langsam das Medium zu entfernen, man aufpassen, nicht die Aggregate am unteren Rand der Vertiefungen nicht zu stören. Nach Reduzierung ter mittlere Ebene auf etwa 1 bis 2 mm von der Mikrotiterplatten-Oberfläche strukturiert, kippen langsam das Plattenmedium an einer Seite des Brunnens zu sammeln (sobald das Volumen ausreichend niedrig ist, wird Fluidbewegung stark reduziert, und es ist einfacher, Aggregate vermeiden angehoben zu werden aus ihren einzelnen Mikrotitervertiefungen). Pipette langsam das restliche Medium in der gut. frisch Stufe 1 Induktionsmedium hinzufügen, während die Aggregate in den einzelnen Kavitäten bleiben gewährleistet: Ziehe 1 ml Stufe 1 Induktionsmedium mit einem P1000 Mikropipetter. Halten der Pipettenspitze gegen die Innenkante des Schachts und sehr langsam das Medium gegen die Innenwand des Schachtes verzichtet werden kann. Wiederholen Sie für die verbleibenden Vertiefungen. Bringen Sie die Platte in den Inkubator unter hypoxischen Bedingungen für 3 Tage. 5. Cardiac Induction Stufe 2 Am Tag 4 Ort Waschmedium (Volumen = Anzahl der Wells x 2 ml) in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min. Bereiten Sie das notwendige Volumen von Stufe 2 Induktionsmedium (Volumen = Anzahl der Brunnen x 1 ml): Pro ml vollständigen Herzinduktionsmedium, fügen Sie 2 ul VEGF-Stammlösung (Endkonzentration = 10 ng / ml) und 0,5 ul IWP-2 Stammlösung (Endkonzentration = 5 & mgr; M). Legen Sie die vorbereitete Phase 2 Induktionsmedium in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min. Mit einem 5 ml serologische Pipette, ernten die Aggregate aus jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte und sammeln die Aggregatsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen (sammeln bis zu 10 Wells pro 15 ml Tube). Lassen Sie die Aggregate für 15 min in einem hypoxischen Inkubator zu begleichen. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, einzelne Zellen und Zelltrümmer von den intakten Aggregate zu trennen. Saugen Sie den Überstand sorgfältig und resuspendieren die Aggregate in 10 ml der vorgewärmten Waschmedium Rest induktive Cytokine zu entfernen (zB ist Activin A ein starkes Signal – Molekül auch bei sehr niedrigen concentrations). Zentrifugieren Sie die Aggregate bei 50 × g für 2 min. Den Überstand aspirieren. Resuspendieren der pelletierten Aggregate in der vorgewärmten Induction 2 Medium. Übertragen Sie die Aggregatsuspension auf eine 24-Well-Ultra-Low-Befestigung (ULA) Platte mit 1 ml pro Vertiefung. Beachten Sie die Aggregate unter dem Mikroskop als einheitliche, feste Zellcluster. Inkubiere unter hypoxischen Bedingungen bis zum Tag 6. 6. Herz Induction Stufe 3 Am Tag 6, das notwendige Volumen von Stufe 3 Induktionsmedium (Volumen = Anzahl der Vertiefungen x 1 ml) herzustellen. Für 1 ml vollständigen Herzinduktionsmedium, fügen Sie 2 ul VEGF-Stammlösung (Endkonzentration = 10 ng / ml) und 0,5 ul bFGF-Stammlösung (Endkonzentration = 5 ng / ml). Vorbereitete Stufe 3 Induktionsmedium in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min. Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette die Aggregate auf 15 ml konischen Röhrchen zu übertragen, zu 10 ml Aggregat Pooling biss pro Röhrchen. Warten Sie 10 min für die Aggregate zu begleichen. Den Überstand aspirieren und resuspendieren die Aggregate in die vorgewärmte Stufe 3 Induktionsmedium. Mit einem 5 ml serologische Pipette, verteilen die Aggregate in einer 24-Well ULA Platte mit 1 ml pro Vertiefung. Am Tag 10 bereiten das notwendige Volumen von Stufe 3 Induktionsmedium (Volumen = Anzahl der Vertiefungen x 1 ml) gemäß Schritt 6.1. Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette die Aggregate auf 15 ml konischen Röhrchen zu übertragen, zu 10 ml Aggregate pro Röhrchen Pooling auf. Warten Sie 10 min für die Aggregate zu begleichen. Den Überstand aspirieren und resuspendieren die Aggregate in Stufe 3 Induktionsmedium. Mit einem 5 ml serologische Pipette, verteilen die Aggregate in einer 24-Well ULA Platte mit 1 ml pro Vertiefung. Inkubiere unter hypoxischen Bedingungen für zwei Tage. Am Tag 12 beginnen , für den Rest der Kulturzeit (37 ° C, 20% O 2, 5% CO 2) der Zellen bei normoxischen Sauerstoffgehalt inkubiert. HINWEIS:Nach diesem Zeitpunkt werden die Zellen nicht kultiviert länger unter hypoxischen Bedingungen. Wiederholen Sie diesen kompletten Austausch des Mediums (Schritte 6.2 und 6.3) alle 4 Tage, Tag, beginnend 14 bis Zellernte (in der Regel sind Spitzen Kardiomyozyten Konzentrationen für Tag beobachtet 14 der Differenzierung). 7. Durchflusszytometrie Analyse von Cardiac Troponin T (cTnT) Expression Häufigkeit der Mikrowell Kultur Output Dissoziieren die Aggregate wie folgt: Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette 1 gut von Aggregaten zu einem 15 ml konischen Röhrchen zu übertragen. Zentrifugieren Sie die Aggregate bei 50 × g für 2 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. 1 ml frisch gelöstes 1 mg / ml Kollagenase Typ II Lösung der Aggregate. Übertragung der Aggregatsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren die Aggregate in Kollagenase Typ II über Nacht bei Raumtemperatur. Am folgenden Tag, verwenden Sie einen P1000 Mikropipetter sanft die Aggregate zerfallenzu einer homogenen Einzelzellsuspension. Wenn die Aggregate nicht leicht dissoziieren, siedeln die Aggregate, die den Überstand aspirieren, und brüten die Aggregate in 700 ul Dissociation Enzym für 1 bis 2 Minuten bei RT. Pipette vorsichtig auf die Aggregate 1 bis 2 mal mit einem P1000 Mikropipetter zu distanzieren. Verdünnen Sie die Dissoziation Enzym: In 700 ul Waschmedium mit 14 & mgr; l von 1 mg / ml DNAse-Stammlösung. Nehmen Sie eine 10 ul Probe eine Zellzählung durchzuführen, und Zentrifuge die verbleibende Suspension mit einem Benchtop-Mikro bei 300 g für 2 min mit. Führen Sie eine Zellzahl: Stain die 10 ul Zählprobe mit einem gleichen Volumen von Trypanblau und zählen eine Zählkammer. Entfernen Sie die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen die verbleibenden Zellen aus dem Mikro enthält. Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 200.000 bis 500.000 Zellen pro 100 & mgr; l, in Hanks Balanced Salt Solution, enthaltend2% Fetal Bovine Serum (HF). Für jede Bedingung, dann 100 & mgr; l Zellsuspension pro Vertiefung 2 Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen (ein gut mit der cTnT Antikörper und der andere ist der sekundäre Antikörper-Kontrolle gefärbt werden). Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer mehrkanaligen Mikropipetter. Fix die Zellen: Jeweils 200 ul Fixierungslösung (Kit-Komponente) pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 15 Minuten bei RT. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 2 min. Verwenden Sie einen mehrkanaligen Mikropipetter zu den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen zurückziehen. Entsorgen Sie den Überstand in einem Paraformaldehydabfallbehälter. Waschen Sie die fixierten Zellen zweimal: Jeweils 200 & mgr; l von HF zu jeder Vertiefung. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 2 min. Den Überstand aspirieren, und wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Die fixierten Zellen können bis zu einer Woche in HF bei 4 ° C gelagert werden. Permeabilisierung der Zellen: Zentrifugieren Sie die Platte bei 300· g für 2 min. 100 l Permeabilisierungs Solution (Kit-Komponente) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 2 min und den Überstand aspirieren. Vorbereiten eines Master-Mix anti-cTnT in HF bei der optimalen Konzentration für den gegebenen Chargennummer (Die optimale Verdünnung durch Titration bestimmt werden muss und typischerweise im Bereich von 1: 500 bis 1: 2000). Für jede Bedingung (2 Wells pro Zustand), 100 & mgr; l Master-Mix in eine Vertiefung (gefärbte Probe) und 100 & mgr; l von einfachen HF mit dem anderen gut (sekundäre Antikörper-Kontrolle). Inkubieren der Zellen bei 4 ° C für 30 min. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 2 min. Den Überstand aspirieren und fügen Sie pro Vertiefung 200 ul HF. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal. Bereiten Sie einen Master-Mix des sekundären Antikörpers. Wird ein Volumen von HF, die für jeden gut (sekundäre Antikörperkontrolle zu 100 & mgr; l entspricht undcTnT-gefärbt) behandelt werden. 1 & mgr; l Ziegen-anti-Maus-sekundären Antikörper APC pro 200 ul HF (1: 200 Verdünnung). Beflecken die Proben. 100 l Färbelösung in jede Vertiefung (sowohl den sekundären Antikörper-Kontrolle und Anti-cTnT befleckten Brunnen). Inkubieren Zellen im Dunkeln bei 4 ° C für 30 min (die Platte bedeckt halten oder in der Dunkelheit nach, fluoreszierenden sekundären Antikörper Zugabe zu vermeiden Photobleaching). Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 2 min. Den Überstand aspirieren und fügen Sie pro Vertiefung 200 ul HF. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal. Übertragen Sie die Proben zu 5 ml Rundboden Durchflusszytometer Analyse Röhren und führen die Durchflusszytometrie für Signal in dem APC – Kanal 19 die Standardprotokolle für das Instrument.