Aggregate Size Optimization in Microputjes voor Suspension basis Cardiac Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

1. Bereiding van mediumcomponenten Bereid Wash Medium. Per 100 ml van DMEM / F12, voeg 1 ml 100 x penicilline / streptomycine (Pen / Strep), 1 ml 100x L-glutamine en 5 ml serum vervangen. Bereid de chemisch gedefinieerde Basal Cardiac inductiemedium volgens de instructies van de fabrikant. De volgende voorraadoplossingen reagentia voor media die worden gebruikt in dit protocol. L-Ascorbinezuur: Bereid een voorraadoplossing van 5 mg per ml in 4 ° C, steriel ultrazuiver water op in een conische buis. Laat deze oplossing op ijs en vortex de buis periodiek totdat de opgeloste stof volledig is opgelost. Filter-steriliseren ascorbinezuur oplossing om met een 0,22 pm spuitfilter. Bereid 1 ml aliquots van de oplossing ascorbinezuur en deze fracties bewaren bij -20 ° C. Gebruik een vers ontdooide portie telkens medium wordt bereid. Op de dag van mediumbereidingVerdun 13 pl monothioglycerol (MTG) in 1 ml basaal Cardiac inductiemedium. Gooi ongebruikt, verdund MTG. Bereid 1 ml aliquots transferrine (30 mg / ml) op te slaan bij -20 ° C. WINKEL ontdooid porties bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden. Bereiden 4 mM zoutzuur (HCl) dat 0,1% runderserumalbumine (BSA). In een zuurkast, voeg 30 ul van 6,0 N HCl-oplossing tot 50 ml ultrapuur gedestilleerd water. Filter-steriliseren van de oplossing met behulp van een 0,22 pm spuitfilter. Voeg 2 ml van 25% BSA oplossing voor de 50 ml HCl-oplossing. Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,1% BSA. Voeg 20 pl 25% BSA oplossing per ml PBS. Bereid Human botmorfogenetisch Protein 4 (BMP-4) stock-oplossing (10 ng / ul). Los 10 g gevriesdroogd BMP-4 in 1 ml van 4 mM HCl-bufferoplossing met 0,1% BSA. Bereid 50 ul aliquots op te slaan bij -20 ° C. Bereid menselijke fibroblast groeifactor 2 (bFGF) stockoplossing(10 ng / ul). Los 10 mg gelyofiliseerd bFGF in 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,1% BSA. Bereid 50 ul aliquots op te slaan bij -20 ° C. Bereid humane vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) stock-oplossing (5 ng / ul). Los 5 mg gelyofiliseerd VEGF in 1 ml PBS met 0,1% BSA. Bereid 50 ul aliquots op te slaan bij -20 ° C. Bereid Activin Een voorraad oplossing (10 ng / ul). Los 10 g gevriesdroogd activine A in 1 ml PBS dat 0,1% runderserumalbumine (BSA). Bereid 50 ul aliquots op te slaan bij -20 ° C. Bereid remmer van Wnt-2 productie (IWP-2) stockoplossing (10 mM). Los 2 mg IWP-2 in 429 gl dimethylsulfoxide (DMSO). Bereid 10 ul aliquots op te slaan bij -80 ° C. Bereid Compleet Cardiale Inductie Medium. Aan 100 ml van Basal Cardiac Inductie Medium, voeg 1 ml 100x Pen / Strep, 1 ml 100x L-glutamine, 500 pi van transferrine, 1ml vers ontdooide ascorbinezuur en 300 pi van MTG. Gooi niet-gebruikte medium. 2. Voorbereiding van de Microwell Plate LET OP: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een biologisch veiligheidskabinet. Voeg 0,5 ml wasoplossing (component kit) aan elk putje dat wordt gebruikt op de plaat. Opdat de oplossing in contact komt het gehele oppervlak in elk microputje, centrifuge de plaat bij 840 xg gedurende 2 minuten. Incubeer de plaat gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de spoeloplossing van de putjes. Was elke well tweemaal als volgt: Voeg 1 ml PBS aan elk putje, plaat gecentrifugeerd bij 840 g gedurende 2 min en daarna zuig het PBS. 3. Vorming van HPSC aggregaten in Microwell Plate LET OP: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een biologisch veiligheidskabinet. Plaats Wash Medium in een 37 ° C waterbad. LET OP: Het volume dat nodig = 1 ml x aantal putten HPSC die zal worden losgekoppeld. Distantiëren hPSCs naar enkele cellen OPMERKING: Deze stappen beschrijven de dissociatie van cellen gekweekt op 6 well platen – het reagens volumes kan proportioneel worden geschaald voor andere cultuur formaten. Zuig het kweekmedium uit elk HPSC cultuur goed voor dissociatie. Spoel elk putje met 1 ml dissociatie enzym en vervolgens onmiddellijk zuig dissociatie enzym uit elk putje. OPMERKING: Resterende dissociatie enzym moet voldoende zijn om de cellen te scheiden. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 3 min. Voeg 1 ml van wasmedium aan elk putje en mechanisch scheiden van de cellen van het weefsel kweekoppervlak pipetteren het wasmedium met een P1000 micropipettor via weefselkweek oppervlak. Als de dissociatie lijkt onvolledig en celklonten blijven, laat de suspensie door een zeef op dit punt. Breng de celsuspensie om een ​​15 ml conische buis en opslagde buis in de incubator terwijl de celtelling wordt uitgevoerd in de volgende stap. Voer een celgetal: Pipetteer 10 ul monster van de celsuspensie verzameld in de vorige stap. Voeg 30 pi van trypan Blue en meng de schorsing goed door pipetteren. Transfer 10 pi Trypan Blue-gekleurde cellen aan elke kamer van een hemocytometer en visualiseren onder de omgekeerde microscoop met 10x objectief. Tel de cellen. Vanaf het celgetal resultaten, berekenen hoeveel putten kan worden gezaaid met 1,2 x 10 6 cellen per putje van de microwell plaat. Bereken Aggregatie Medium vereist om de cellen te zaaien op 1 ml per putje. Bereid aggregatie medium. Per 10 ml van volledige Cardiac inductiemedium, voeg 0,5 pl BMP4 voorraadoplossing (eindconcentratie = 0,5 ng / ml) en Y-27.632 ROCK Inhibitor (eindconcentratie = 10 uM). Verwijder de conische buis met de hPSCs uit de incubator en centrifugalege de buis bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig het wasmedium en resuspendeer de cellen in aggregatie medium bij een dichtheid van 1,2 x 10 6 cellen per ml. Zuig het PBS-wasoplossing uit elk putje van de microwell plaat. Met een P1000 micropipettor, verdelen en zaad 1 ml van de celsuspensie aan elk putje van de microwell plaat. Een groot aantal putten zaad periodiek vortex de celsuspensie te voorkomen regelen. Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 5 minuten. De plaat onder de microscoop te bevestigen cellen gecentrifugeerd om de bodem van elk microputje. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 ° C in een 5% CO2, 5% O2 (hypoxische) incubator. 4. Cardiale Inductie Fase 1 Een dag na de samenvoeging (dag 1), de voorbereiding van de vereiste volume van fase 1 inductie medium (voor een plaat met 24 putjes, volume = 1 ml x aantal putten). Voor 1 ml compleetcardiale inductiemedium, voeg 1 pl BMP4 voorraadoplossing (uiteindelijke concentratie = 10 ng / ml), 0,5 pi bFGF voorraadoplossing (uiteindelijke concentratie = 5 ng / ml) en 0,6 ui activine A (eindconcentratie = 6 ng / ml). Plaats het medium in een 37 ° C waterbad gedurende tenminste 15 minuten. Verwijder de microwell plaat uit de incubator. Inspecteer de aggregaten onder de microscoop. In vergelijking met onmiddellijk post-centrifuge aggregatie, moeten ze intact met gladde randen (ronder en minder vierkant dan de vorige dag) verschijnen. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de aggregaten in de microputjes verstoren: Houd de microwell plaat horizontaal niveau (bijv., Niet kantelen). Voor elke put op de plaat microputje, plaatst de punt van een P1000 micropipettor aan het oppervlak van het kweekmedium en tegen de rand van de put. Verwijder langzaam het medium voorzichtig de aggregaten niet te verstoren onderaan de microputjes. Na het verminderen van thij gemiddeld niveau tot ongeveer 1 tot 2 mm van de getextureerde microputje oppervlak langzaam kantelen de plaat medium verzamelen aan één zijde van de put (nadat het volume voldoende laag is vloeiende beweging sterk verminderd en is het gemakkelijker om aggregaten voorkomen dat opgeheven uit hun individuele microwells). Langzaam pipet de resterende medium in de put. Om vers Fase 1 Inductie Medium toevoegen terwijl het waarborgen van de aggregaten in hun individuele microwells blijven: Teken 1 ml van fase 1 inductie medium met een P1000 micropipettor. Houd de pipetpunt tegen de binnenrand van de put en langzaam bereid het medium tegen de binnenwand van de put. Herhaal dit voor de resterende putten. Zet de plaat in de incubator onder hypoxische condities gedurende 3 dagen. 5. Cardiale Inductie Fase 2 Op dag 4, plaats wasmedium (volume = aantal putten x 2 ml) in een 37 ° C waterbad gedurende ten minste 15 min. Bereid de nodige volume Fase 2 inductiemedium (volume = aantal putten x 1 ml) per ml compleet Cardiac inductiemedium, voeg 2 pl VEGF voorraadoplossing (uiteindelijke concentratie = 10 ng / ml) en 0,5 gl IWP-2 stock-oplossing (uiteindelijke concentratie = 5 pm). Plaats de voorbereide Fase 2 Inductie medium in een 37 ° C waterbad gedurende ten minste 15 min. Met een 5 ml serologische pipet, verzamel de aggregaten uit elk putje van de microwell plaat en verzamel het aggregaat suspensie in een 15 ml conische buis (laat maximaal 10 putjes per 15 ml buisje). Laat de aggregaten te regelen voor 15 min in een zuurstofarme incubator. OPMERKING: Deze stap is belangrijk om enkele cellen en celresten gescheiden van de intacte aggregaten. Zuig het supernatant en resuspendeer de aggregaten in 10 ml van de voorverwarmde wasmedium om resterende inductieve cytokinen verwijderen (bijvoorbeeld activine A een potent signaalmolecuul zelfs bij zeer lage concentrations). Centrifugeer de aggregaten bij 50 xg gedurende 2 minuten. Zuig het supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde aggregaten in de voorverwarmde inductie 2 Medium. Breng de totale schorsing van een 24-well ultra-low attachment (ULA) plaat 1 ml per putje. Let op de aggregaten onder de microscoop als uniforme, strakke cel clusters. Incubeer onder hypoxische condities tot en met dag 6. 6. Cardiale Inductie Fase 3 Op dag 6, bereidt de nodige volume Fase 3 Inductie Medium (volume = aantal putten x 1 ml). Voor 1 ml compleet Cardiac inductiemedium, voeg 2 pl VEGF voorraadoplossing (uiteindelijke concentratie = 10 ng / ml) en 0,5 pl voorraadoplossing bFGF (uiteindelijke concentratie = 5 ng / ml). Plaats bereid Fase 3 inductiemedium in een 37 ° C waterbad gedurende ten minste 15 min. Gebruik een 5 ml serologische pipet tot de aggregaten conische buizen overbrengen naar 15 ml, bundelen tot 10 ml aggregaats per buis. Laat 10 min voor de aggregaten te vestigen. Zuig het supernatant en resuspendeer de aggregaten in de voorverwarmde Fase 3 inductiemedium. Met behulp van een 5 ml serologische pipet, te herverdelen de aggregaten in een 24-well ULA plaat 1 ml per putje. Op dag 10, bereidt de nodige volume Fase 3 Inductie Medium (volume = aantal putten x 1 ml) volgens Stap 6,1. Gebruik een 5 ml serologische pipet tot de aggregaten overbrengen naar 15 ml conische buizen, bundelen tot 10 ml per buis aggregaten. Laat 10 min voor de aggregaten te vestigen. Zuig het supernatant en resuspendeer de aggregaten in Fase 3 Inductie Medium. Met behulp van een 5 ml serologische pipet, te herverdelen de aggregaten in een 24-well ULA plaat 1 ml per putje. Incubeer onder hypoxische omstandigheden gedurende twee dagen. Op dag 12, beginnen de cellen te incuberen in normoxische zuurstofniveaus gedurende de rest van de kweekperiode (37 ° C, 20% O2, 5% CO2). NOTITIE:Na dit tijdstip, cellen niet meer gekweekt onder hypoxische omstandigheden. Herhaal deze volledige medium uitwisseling (Stappen 6.2 en 6.3) om de 4 dagen, te beginnen op dag 14 tot cel oogst (meestal piek cardiomyocyt concentraties waargenomen na dag 14 van differentiatie). 7. Flowcytometrieanalyse van troponine T (cTnT) Expression Frequentie van Microwell Cultuur Output Distantiëren de aggregaten als volgt: Gebruik een 5 ml serologische pipet 1 en aggregaten overbrengen naar een 15 ml conische buis. Centrifugeer de aggregaten bij 50 xg gedurende 2 min en voorzichtig zuig de supernatant. Voeg 1 ml vers opgelost 1 mg / ml collagenase type II oplossing van de aggregaten. Breng de aggregaat suspensie naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Incubeer de aggregaten collagenase type II een nacht bij kamertemperatuur. De volgende dag, gebruik een P1000 micropipettor voorzichtig dissociëren de aggregatenin een homogene enkele celsuspensie. Wanneer de aggregaten niet gemakkelijk dissociëren de aggregaten bezinken, zuig de supernatant en incubeer de aggregaten in 700 pl dissociatie enzym gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Voorzichtig pipet de aggregaten 1-2 maal met een P1000 micropipettor dissociëren. Verdun de dissociatie enzym Voeg 700 ul van wasmedium met 14 ui van 1 mg / ml DNAse voorraadoplossing. Neem een ​​10 ul monster tot een celgetal uit te voeren, en centrifuge de resterende suspensie met behulp van een bench-top microcentrifuge bij 300 g gedurende 2 minuten. Voer een celtelling: Vlekken de telling 10 pl monster met een gelijk volume van trypan blauw en tellen met een hemocytometer. Verwijder de microcentrifugebuis van 1,5 ml dat de resterende cellen van het microcentrifuge. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in een concentratie van 200.000 tot 500.000 cellen per 100 pl, in Hanks gebalanceerde zoutoplossing bevattende2% foetaal runderserum (HF). Voor elke voorwaarde, overdracht 100 ul celsuspensie per putje tot 2 putjes van een 96-well plaat (een putje wordt gekleurd met de cTnT antilichaam en de ander het secundaire antilichaam controle heeft). Centrifugeer de plaat bij 300 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant met een meerkanaals micropipettor. Fixeer de cellen Voeg 200 pl fixeeroplossing (kit component) per putje en incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de plaat bij 300 xg gedurende 2 minuten. Gebruik een meerkanaals micropipettor aan het supernatant voorzichtig terugtrekken uit de putjes. Gooi de bovenstaande vloeistof in een container paraformaldehyde afval. Was de vaste cellen tweemaal Voeg 200 ul van HF aan elk putje. Centrifugeer de plaat bij 300 xg gedurende 2 minuten. Zuig het supernatant en herhaal het wassen stap nog een keer. Gefixeerde cellen kan worden bewaard tot een week in HF bij 4 ° C. Permeabilize de cellen: Centrifugeer de plaat bij 300xg gedurende 2 minuten. Voeg 100 ul van permeabilisatie oplossing (component kit) aan elk putje en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Centrifugeer de plaat bij 300 xg gedurende 2 min en zuig de supernatant. Bereid een master mix van anti-cTnT in HF in de optimale concentratie voor het gegeven partijnummer (De optimale verdunning wordt bepaald door titratie en typisch varieert van 1: 500 tot 1: 2000). Voor elke voorwaarde (2 waterputten per conditie), voeg 100 ul van master mix tot een goed (gekleurd monster) en 100 pl vlakte HF aan de andere goed (secundair antilichaam controle). Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 2 min. Zuig het supernatant en voeg 200 ul per putje van HF. Herhaal deze wasstap nog een keer. Bereid een master mix van het secundaire antilichaam. Breng een hoeveelheid van HF die overeenkomt met 100 gl van elk putje (secundair antilichaam controle en-CTnT gekleurd) behandeld. Voeg 1 pl geit anti-muis secundair antilichaam APC per 200 gl HF (1: 200 verdunning). Vlekken op de monsters. Voeg 100 gl kleuroplossing aan elk putje (zowel het secundaire antilichaam controle en anti-cTnT gekleurd putjes). Incubeer cellen in het donker bij 4 ° C gedurende 30 min (houd de plaat bedekt of in het donker na toevoeging fluorescerend secondair antilichaam te voorkomen fotobleken). Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 2 min. Zuig het supernatant en voeg 200 ul per putje van HF. Herhaal deze wasstap nog een keer. Breng de monsters 5 ml ronde bodem flowcytometer analyses buizen voeren flowcytometrie voor signaalverwerking in de APC kanaal met de standaardprotocollen voor het instrument 19.