Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em> İn Vivo</em> ve<em> İn Vitro</em> Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

1. Maya İki hibrid Maya Dönüşümü Aşağıdaki medya ve tamponlar hazırlayın: 20 g / L pepton, 10 g / L maya ekstresi,% 2 w / v glükoz (otoklav sonra ilave edilmiş) ve 20 g / L agar karıştırılarak maya tam maya ekstresi-pepton dekstroz (YPD) orta hazırlayın (plakaları için) ; otoklavda sterilize ve deney gününde taze kullanın. 6.7 g / maya azot baz L, 1.6 g / L Eksikliği ek yoksun lösin ve triptofan,% 2 w karıştırılarak (her ikisi de yem ve hedef plazmidleri seçici baskı tutmak için eksik lösin ve triptofan), maya minimal sentetik tanımlı (SD) orta hazırlayın / h glukoz (plakaları için) (otoklav sonra ilave edilmiş) ve 20 g / L ağar; otoklavda sterilize ve deney gününde taze kullanın. B% 50 Hazırlama / PEG (polietilen glikol) 3350 V; Oda sıcaklığında 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden sterilize edin. 100 mM Tris / 10 mM EDTA (10x TE) Hazırlama ayarlamakPH'ı 7.5'e, oda sıcaklığında, bir 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden sterilize edin. 1 M lityum asetat (10 x LiAc) hazırlanması; , CH3COOH ile pH'ı 7.5'e ayarlayın, oda sıcaklığında, bir 0.2 mikron filtre ve mağaza sterilize edin. YPD bir plaka üzerine dondurulmuş gliserol stokunun bir miktar çizgiler ile Y2H suşu (örneğin, Y190) canlandırmak. maya kolonileri çapı yaklaşık 2 mm üzerine gelinceye kadar 30 ° C'de inkübe edilir (genellikle 3-5 gün, maya suşu bağlı olarak). kolonisinin – (çap 3 mm 2), tek bir büyük ile (1.5 ml tüp içinde) YPD 0.5 ml inoküle edin. Vortex şiddetle 2 ~ min herhangi kümeleri dağıtmak için. 50 mi YPD ortamı içeren 500 ml'lik bir şişeye hücre süspansiyonu aktarın. hareketsiz faz ulaşmak için maya için 250 rpm'de çalkalanarak 18 saat – 16 için 30 ° C'de inkübe edin. Aktarım 4 – (a, 1 litrelik koni şeklindeki bir şişede) YPD 200 ml gecelik kültürün 5 mi, 600 nm'de (OD600 bir optik yoğunluk elde etmek, ölçülen0.2 spektrofotometre) kullanarak – 0.3 (200 ml) 20 dönüşümler için yeterli olacaktır. 0.6 (genellikle 2 – 3 – saat) hücreler, orta log fazında, örneğin, OD 600 = 0.5 olana kadar, 250 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de inkübe edin. santrifüj ile hasat maya oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g'de (50 mi tüp). Süpernatantı atın birlikte steril H 2 O ve havuz 5 ml her pelletini. Yeniden santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g'de ve supernatant atın. taze hazırlanmış steril 1 x LiAc / TE 1 ml içinde süspanse maya pelet. NOT: hazırlık 1 saat içerisinde yetkili maya hücreleri kullanın. 200 tek dönüşümler için plazmid DNA ng veya 0.5 ekleyerek (1.5 ml tüpler) plazmid örnekleri hazırlamak – ko-dönüşümler için her plazmid DNA'nın 1 ug ve ringa balığı testislerin 100 ug taşıyıcı DNA (20 dakika kaynatılır ve üzerinde soğutmalı ) kullanmak için buz hemen önce. NOT: pozitif kontrol, örneğin dahil, maya.ko-transforme pVA3 ve pTD1 (SV40 geniş T antijeni ile GAL4 AD füzyon için kodlama) (GAL4 DNA-BD p53 proteini ile füzyon için kodlama) ile. taze hazırlanmış, kompetan maya süspansiyonu (basamak 1.1.8) 100 ul ve 1 x LiAc / PEG çözeltisi 600 ul (stok 8 ml PEG 3350, hazır TE 1 ml stok LiAc 1 mi) ve vorteks ekleme ~ 30 san. 200 rpm'de çalkalanarak 30 dakika 30 ° C'de inkübe edin. dimetil sülfoksit (% 10 hacim / hacim nihai konsantrasyon) 80 ul ekle ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırın. 3 dakika – 42 ° C bir su banyosu içinde 15 dakika süreyle ısı şoku her 2 karıştırılarak. maya kurtarmak için oda sıcaklığında 15 saniyede 14,000 x g'de 2 dakika ve santrifüj buz üzerinde hücre süspansiyonu Chill. Uygun az SD ortamı plakaları üzerinde tekrar süspansiyon hücre 1X TE 100 ul pelet ve plaka seçici büyütülmesi için (ortam her iki yem ve hedef plazmidleri seçici basınç tutmak için lösin ve triptofan içermeyen). yukarı tarafı aşağı 30 inkübe(- 5 gün genellikle 4) koloniler çapı ~ 2 mm kadar ° C. Plakalar 2, 4 ° C'de saklanabilir – 3 hafta; daha uzun depolama için -80 ° C'de gliserol stokları ve depolayın. NOT: 17 immün o yem ve hedef proteinler maya ifade edilir doğrulayın ve (Bölüm 1.3 de açıklandığı gibi β-Gal deneyi ile) ayrı ayrı mayada ifade edildiğinde bunlar otonom raportör gen aktivasyonunu yok. Koloni-lift Filtre Kağıdı β-Gal Testi Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: 100 mM Na-2 HPO 4, Z'yi içeren tampon hazırlayın 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO 4; PH 7.4 ayarlanır. Oda sıcaklığında otoklav ve mağaza tarafından sterilize edin. çözülmesiyle X-Gal tamponu hazırlayın 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid ile -20 ° C'de karanlıkta, N, N-dimetilformamid ve mağaza 20 mg / ml'de. Z tampon / X-Gal çözeltisi hazırlayın. tampon yapınZ, tampon içinde 0.27% v / v 0.33 mg / ml ve β-merkaptoetanol X-Gal karıştırılarak sağlamak üzere ayrılabilirler. Numune başına 2.5 ml kullanın. Ekle bir selüloz filtre kağıdı içine, temiz bir 100 mm'lik plaka ve yerine taze hazırlanmış Z tampon / X-Gal çözeltisi 2.5 mi. maya kolonileri analiz edilecek olan plakanın yüzeyi üzerine yeni bir filtre kağıdını. Yavaşça forseps ile plaka üzerine filtre kağıdı ovmak ve takmak için koloniler ~ 5 dakika bekletin. Not:. Paralel pozitif kontrol, yani, maya pVA3 ve pTD1 ile ko-transformasyona işleyin. (; Her zaman kalın eldiven ve gözlük sıvı azot dikkatle ele alınmalıdır) filtre kağıdı kaldırın ve 30 saniye süreyle sıvı azot havuza (forseps ile) daldırın. Yaklaşık 2 dakika boyunca oda sıcaklığında dondurulmuş filtre kağıdı çözülme olsun. 100 mm plaka içindeki önceden ıslatılmış filtre kağıdı üzerine filtre kağıdı (kadar koloni tarafı) yerleştirin ve 30 ° C'de inkübe edin. periyodik kontrolmavi koloniler ortaya çıkması için (her ~ 30 dakika). Maya Y190 birlikte dönüştürülmüş pozitif kontrol plazmidler (pVA3 + pTD1) ile 60 dakika (yayınlanmamış gözlemler) içinde maviye döner. NOT: Zayıf yem: Hedef etkileşimler (uzun süreli inkübasyon yalancı pozitif sonuçlar verebilir (> 8 saat) kaçının) pozitif mavi sinyal üretmek için birkaç saat sürebilir. En iyi sonuçlar için, örneğin, taze olarak birlikte dönüştürülmüş koloniler, kullanımı, 4 30 ° C'de büyütüldü -. 5 gün sonra, ~ çapı 2 mm. Sıvı kültür β-Gal Deneyi Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: 100 mM Na-2 HPO 4, Z'yi içeren tampon hazırlayın 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO 4; 7.4 pH ayarlamak oda sıcaklığında otoklav ve mağaza tarafından sterilize edin. 1 M Na 2 CO 3; Oda sıcaklığında saklayın. Z tampon / p-merkaptoetanol hazırlayın. % 0.27 v β-merkaptoetanol ekleyerek kullanmak için tampon önce yapmak /Z, tampon maddesi içinde V; örnek başına 700 ul kullanın. Z tampon / ONPG çözüm hazırlayın. önceden tampon Z tamponu içinde hac / hac% 0.27 4 mg / ml ve β-merkaptoetanol de oNPG (o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosid) karıştırılması ile kullanmak için yapın; örnek başına 160 ul kullanın. 250 rpm'de çalkalanarak, 18 saat – (her ikisi de yem ve hedef plazmidleri seçici baskı tutmak için eksik lösin ve triptofan) ve 16 için 30 ° C'de inkübe az SD ortamı 5 ml aşılamak için tek bir koloni kullanın. NOT: Deney beş ayrı koloniler aynı yem ve hedef plazmid ile transforme co. 0.3 – OD 600 = 0.2 üretilmesi için taze SD ortamı 10 ml, gece boyunca kültürün kadar aktarın. Hücreler, orta log fazına (- 0.6 OD 600 = 0.5) olana kadar, 250 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında 2 dakika için 14,000 x g'de 1.5 ml tüp ve santrifüj içine maya kültürü 0.5 mL aktarın. Ce hasat sırasında tam OD 600 kayıtrf. Z tampon 100 ul yeniden süspanse pelet; Bu 5 kat bir yoğunlaşma katsayısına neden olur. ve daha sonra 37 ° C su banyosunda 3 dakika çözülme için, sıvı nitrojen içinde yer tüpü ~ 1 dak için (her zaman kalın eldiven ve gözlük sıvı nitrojen dikkatle ele alınmalıdır). Hücreler açık kırık sağlamak için bu donma-çözülme döngüsü iki kez daha tekrarlayın. Z tampon 100 ul boş bir tüp ayarlayın. Z tampon / ß-merkaptoetanol 700 ul ve örnek ve boş tüpler Z tampon / ONPG 160 ul ekleyin; 30 ° C inkübatör zamanlayıcı ve yeri başlatın. Sarı renk geliştirmek için periyodik olarak kontrol edin. Renk gelişimini durdurmak ve birkaç dakika içinde geçen süreyi kaydetmek için 1 M Na 2 CO 3 400 ul ekleyin. Maya Y190 ko-transforme edilmiş pozitif kontrol plazmid (pVA3 + pTD1) ile 60 dakika içinde sarıya döner .. NOT: Zayıf yem: Hedef etkileşimleri en iyi re için pozitif sarı sinyal üretmek için birkaç saat sürebilirneticeleri, taze birlikte dönüştürülmüş koloniler kullanım, yani, 4 30 ° C'de büyütüldü -. 5 gün sonra, ~ çapı 2 mm. Hücre yıkıntıları pelet haline ve temiz bir küvet içine süpernatant aktarmak için oda sıcaklığında 5 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin. Bir spektrofotometre kullanılarak, (1.0 – 0.02 arasında olmalıdır değerleri) boş göre örneklerin 420 nm'de (420) emilimi ölçün. aşağıdaki formüle göre, O-nitrofenol ve tekrar hücre başına dakika başına D-galaktoz için ONPG 1 umol hidrolize miktar olarak tanımlanır 1 birim, β-galaktosidaz birimleri hesaplayın: = Β-galaktosidaz birimleri Burada: T: (dakika olarak) inkübasyon için geçen zaman; . cf: Adım 1.4.8, yani gelen konsantrasyon faktörü, cf = 5; OD 600: hücreler hasat zaman. Bir memeli hücre soyunda 2. Protein Ekspresyonu <stRong> Memeli HÜCRE NAKLİ Aşağıdaki medya ve tamponlar hazırlayın: 4.5 g / L glukoz,% 10 h / h cenin sığır serumu ve 2 mM L-glutamin ile DMEM karıştırılarak büyüme ortamı hazırlamak; 4 ° C'de 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden sterilize edin. 280 mM NaCI, 10 mM KCI, karıştırılarak 2x HEPES-tamponlu tuzlu su (2x HBA) hazırlanması 1.5 mM Na-2 HPO 4, 12 mM glikoz, 50 mM Hepes; , 7.05 pH ayarlamak -20 ° C'de, bir 0.2 mikron filtre ve mağaza sterilize edin. -20 ° C'de 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden 2.5 M CaCl 2. sterilize hazırlayın. Transfeksiyondan bir gün önce, tohum 1 – için bir 100 mm Petri kabı 2 x 10 6 HEK293 hücreleri% 60-70 konfluent ertesi gün için. % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de, 18 saat – 16 kültürü. Transfeksiyon gününde, taze büyüme ortamına, 10 ml eski orta ve besleme hücreleri çıkarmak. NOT: Onlar hücre ölümünü artırabilir çünkü antibiyotikler transfeksiyon sırasında kültür ortamından çıkarılmıştır. 600 ul toplam hacim içinde 2.5 M CaCI2, 60 ul (ko-transfeksiyon, iki plazmidin eşit mol oranı) plazmid DNA 24 ug seyreltilir 1.5 ml tüp içinde (steril deiyonize H2O ile yapılan); girdap karıştırmak için. Not:. En transfeksiyon verimi için, plazmid DNA, yüksek saflıkta, yani olması gereken bir Abs 260 / Abs 280 oranı = ~ 1.8 sahiptir. sürekli ve güçlü bir şekilde vorteks yoluyla karıştırılarak 2x HBS 600 ul ihtiva eden 50 ml'lik bir tüp içine akıllıca plazmid DNA / kalsiyum çözeltisi damla ekleyin. kalsiyum fosfat / plazmid DNA kompleksleri oluşumu sağlamak için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. 20 dakika inkübasyon, girdap kısaca sonra, 100 mm Petri kabı tüm yüzey alanını kaplamak için hücreler üzerine akıllı çözeltisi damla ekleyin. % 5 CO, 37 ° C de inkübe hücreleri <sub> 2. ~ 6 saat sonra büyüme ortamı değiştirmek ve inkübatör geri koyun. Oda sıcaklığında 3 dakika 1000 xg'de santrifüjleme ile hücreler 24 saat sonra transfeksiyon Hasat ve supernatant atın. gerekli olana kadar Hücre topakları -80 ° C'de saklanabilir. NOT: – 72 saat sonrası transfeksiyon İfade genellikle 24 doruklarına. hücre Homojenizasyon Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: 150 mM NaCl, 20 mM Tris karıştırılarak Co-IP homojenizasyon tamponu hazırlayın; 7.4 pH ayarlamak ve 4 ° C'de depolayın. 5 mM HEPES, 0.3 M sukroz karıştırılarak homojen hale getirme tamponunda Çapraz bağlama hazırlanması; 7.4 pH ayarlamak ve (herhangi bir partikülleri ortadan kaldırmak için kullanılmadan önce filtre), 4 ° C'de depolayın. Kullanmadan önce, proteaz inhibitörleri ile takviyesi. 1.5 ml tüp içinde – (600 mikron 425) ve homojenizasyon tamponu 500 ul ile yıkayın cam boncuklar 250 ul ekleyin. Kısaca santrifüj ile pelet cam boncuklarnabız (5 sn 1000 xg) ve süpernatant kaldırmak. bir kez daha bu yıkama işlemi tekrarlayın. Tekrar süspansiyon hücre buz soğukluğunda homojenizasyon tamponunda 500 ul (aşama 2.1.8 arasında) pelet ve cam boncuklar ihtiva eden bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın. 1 ml şırınga bağlı ince bir iğne içinden 20 geçitlerin (23 g, 0.6 x 30 mm) ile buz üzerinde hücreleri homojenize edilir. Tüp kapağı iğne ile delip içinden, kapalı ve cam boncuklar yoluyla şiddetle hücre süspansiyonu dağıtmak ile. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj çekirdekleri ve kesintisiz hücreleri çıkarmak ve pelet atmak için. post-nükleer fraksiyonu temsil süpernatant kaydedin ve doğrudan işbirliği IP veya çapraz bağlama uygun hareket edin. 3. In vitro Biyokimyasal Yöntemler Ko-immünopresipitasyon Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: de tarif edildiği gibi Co-IP homojenizasyon tamponu hazırlayınection 2.2.1.1. 20 mM Tris, 150 mM NaCI,% 0.5 karıştırılarak IP tampon hazırlanması (a / h) CHAPS, 2mM ditiyotreitol (isteğe bağlı, ditiyotreitol nedeniyle hava oksidasyonu için kurulan protein olabilir agrega azaltmak için ilave edilebilir); 7.4 pH ayarlamak ve 4 ° C'de depolayın. CO-IP homojen hale getirme tamponunda h CHAPS /% 2 w hazırlanması; 4 ° C'de saklayın. 60 mM Tris / h SDS,% 10 hac / hac gliserol, 5 mM EDTA,% 0.01 Mavi V bromofenol w /% 2 h / h β-mersaptoetanol (isteğe bağlı)% 2 w karıştırılarak protein yükleme tamponu hazırlayın; RT'de 6.8 pH ve mağaza ayarlayın. Konfluent 100 mm Petri kabı hücreleri homojenize (~ 8 x 10 6 hücre hemasitometre kullanımı ile sayılır HEK293, eğer) Bölüm 2.2'de açıklandığı gibi. sabit karıştırma ile 4 ° C sıcaklıkta ≥2 saat boyunca post-nükleer hücre altı% 0.5 CHAPS olan fraksiyon (% 2 stoku kullanılarak) ve inkübasyon çözünürleştirilir. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüjleyin çözünmeyen Materi peletEl ve pelet atın. süpernatant olarak adlandırılan hücre lizat kaydedin. Not: bir deterjan ve çözünmeyen malzemenin çıkarılması dahil spesifik olmayan en aza indirmek için kesinlikle gereklidir. . Aramadde deterjanlar örn CHAPS ya da Triton X-100, 0.2 bir konsantrasyonda -% 1, en ​​sık kullanılanlardır. 6 mg / ml protein-A ya da protein G agaroz (veya sefaroz) boncuk (IgG bağlanma kapasitesine bağlı olarak) iki ayrı 1.5 ml tüpler hazırlamak ve ~ 20 ul ekle. IP tampon 200 ul ile yıkayınız. Not: immüno-çökeltilmesinin antikor geliştirmek için kullanılabilir hayvan türlerine bağlı olarak, uygun olan Ig-bağlama reçine seçin. Protein-G-protein-A ile karşılaştırıldığında Ig alt tiplerinin daha geniş bir aralıkta bağlanır. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj ile boncuk kurtarmak. Bir kez daha, IP tampon maddesi ile tekrar yıkama, sonra IP tampon 200 ul boncuk tekrar süspansiyon. göster (immüno-çökeltilmesinin antikor ya da olmayan bağışıklık IgG 1 ug (5 ng / | il) ilaveiki ayrı Protein-A / G ihtiva eden tüpler içinde negatif kontrol olarak) vermektedir. sabit karıştırma ile 4 ° C sıcaklıkta ≥2 saat süreyle inkübe edin. NOT: Her zaman immüno-çökeltilmesinin antikoru ile aynı hayvan türlerinde ortaya olmayan bağışıklık IgG kullanımı ile bir negatif kontrol işlem. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj ile boncuk yeniden elde etmek ve dikkatli bir şekilde pipetleme süpernatant atılır. antikor ve Protein-A / G boncuklar iki tüpün her birine (aşama 3.1.3 arasında), hücre lizat 200 ul aktarın. Antijen-antikor bağlanması için izin vermek için, sabit karıştırma ile 4 ° C sıcaklıkta ≥2 saat süreyle inkübe edin. boncuk kurtarmak ve IP tampon 200 ul ile yıkayın; karıştırılarak 4 ° C'de 10 dakika inkübe edilir. (Spesifik ve spesifik olmayan bağlanma, her iki azaltacaktır birden fazla yıkama kaçının) boncuk yeniden elde etmek ve iki kez daha yıkanır. Dikkatle pipetleme süpernatant atın. immunoprecipit elüte etmek için protein yükleme tamponu 30 ul ekleATED proteinleri. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj, boncuk atmak ve elüt ko-IP örneği içeren süpernatant kaydedin. Başarılı bir protein X çökelmesini kontrol etmek için, bir kısım dahil, protein X için özel bir antikor ile 17 immün analiz edilecek bir SDS-PAGE jeli üzerinde eş bir IP örnek bir miktar (1/10, 3 ul) yük hücre lizatı sizin örnekteki protein X ifadesini doğrulamak için. Ayrı bir SDS-PAGE jeli üzerinde eş-IP numunenin geri kalanı (9/10 th, 27 ul) yüklemek, ko-çökeltilmiş protein, Y varlığı açısından test etmek için, protein Y için özel bir antikor ile 17 immün analiz edilecek senin örneğinde protein Y ifadesini doğrulamak için hücre lizat bir kısım yer alır. Kimyasal zıt-bağlantı Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: Bölüm 2.2.1.1 de tarif edildiği gibi ancak homojenizasyon tamponu Çapraz bağlama. 5x p hazırlayınrotein yükleme tamponu 300 mM Tris / h SDS,% 50 hac / hac gliserol, 25 mM EDTA,% 0.05 Mavi V bromofenol w /% 10 v / v β-mersaptoetanol (isteğe bağlı)% 10 w karıştırarak; RT'de 6.8 pH ve mağaza ayarlamak; kullanımdan önce, 50 ° C'de ısıtın. Konfluent 100 mm Petri kabı hücreleri homojenize (~ 8 x 10 6 hücre hemasitometre kullanımı ile sayılır HEK293, eğer) Bölüm 2.2'de açıklandığı gibi. Not: Sakaroz (0.3M at) izo-ozmotik bir tampon oluşturmak için kullanılır. Tuz, örneğin, 120-150 mM, NaCl veya KCI'dir ilgi oligomerik protein kompleksi ile ilgili olarak, bunun yerine kullanılabilir. Protein topakları gece boyunca pelet ve supernatant kaydetmek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 xg'de post-nükleer hücre altı fraksiyonu santrifüjleyin. Ayrı 0.5 ml tüpler içinde (tipik olarak protein ~ 20 ug), 20 | il her bir sekiz alikotları al. Bütün numuneler için% 0.0025 h / h glutaraldehid ilave edin ve zaman ölçeri başlat. Sekiz numunelerin her glutarald ile reaksiyona izinoda sıcaklığında ehyde: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 dak. Not: glutaraldehit serbest aminler ile reaksiyona giren iki aldehid grubuna sahiptir. bunlar glutaraldehit reaksiyonu söndürmek çünkü pH tamponları veya birincil amino gruplarıyla diğer maddeleri kullanmayın. % 2 hac / hac hidrazin ile belirlenen zamanda glutaraldehid reaksiyonu durdurun ve proteinleri denatüre etmek için 5 kat protein yükleme tamponu 5 ul ekle. SDS-PAGE ve immunoblotting 17 geçin.