대한 유전 및 생화학 적 접근<em> 생체</em> 및<em> 체외</em> 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

1. 효모 두 하이브리드 효모 변환 다음 미디어와 버퍼를 준비합니다 20g / L 펩톤, 10g / L의 효모 추출물, w 2 % / V 포도당 (고압 증기 멸균 후에 추가) 및 20g / L의 한천을 혼합하여 효모 전체 효모 추출물 – 펩톤 – 덱스 트로 오스 (YPD) 매체를 준비합니다 (판에만 해당) ; 고압 증기 멸균에 의해 살균과 실험의 날에 신선한 사용합니다. 6.7 g / 효모 질소베이스의 L, 1.6 g / L 드롭 아웃 보충 부족 류신과 트립토판, 2 % w를 혼합하여 (모두 미끼 및 대상 플라스미드에 선택적 압력을 유지하기 위해 부족 류신과 트립토판) 효모 최소 합성 정의 (SD) 매체 준비 / V 포도당 (판 만)을 (고압 증기 멸균 후에 추가) 및 20g / L 한천; 고압 증기 멸균에 의해 살균과 실험의 날에 신선한 사용합니다. w는 50 %를 준비 / PEG (폴리에틸렌 글리콜) 3350 V; RT에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 소독. 100 mM 트리스 / 10 mM의 EDTA (10 배 TE)를 준비, 조정7.5 pH는 RT에서 0.2 ㎛의 필터를 통해 살균 및 저장. 1 M 리튬 아세테이트 (LiAc들을 배)을 제조; , CH 3 COOH와 7.5 pH를 조정 RT에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 소독. YPD 접시에 냉동 글리세롤 주식의 작은 금액을 질주하여 Y2H 균주 (예, Y190)를 부활. 효모 식민지 직경 ~ 2mm에 도달 할 때까지 30 ° C에서 품어 (일반적으로 3-5일, 효모 균주에 따라 다름). 식민지 – (직경 3mm 2) 하나의 큰과 (1.5 ML 튜브에서) YPD 0.5 ml에 접종한다. 소용돌이는 적극적으로 2 ~ 분간은 덩어리를 분산합니다. 50 ㎖ YPD 배지를 함유하는 500 mL의 플라스크에 세포 현탁액을 전송. 정지상 도달하는 효모에서 250 rpm으로 진탕하면서 18 시간 – 16 30 ℃에서 인큐베이션. 전사 4 – (1 L 삼각 플라스크에) YPD 200 ㎖로 하룻밤 배양을 5 ml의 600 nm의 (OD 600에서 광 밀도를 생성하는 측정0.2의 분광 광도계)를 사용하여 – 0.3 (200 ml를하면) 20 변환에 대한 충분한 것입니다. 0.6 (보통 – 2 – 3 시간) 세포 중순 로그 단계, 즉, OD 600 = 0.5가 될 때까지 250 rpm으로 진탕 30 ° C에서 품어. 원심 분리하여 수확 효모 RT에서 5 분 1,500 XG에 (50 ml의 튜브). , 상층 액을 버리고 함께 멸균 H 2 O와 풀 5ml에 각 펠렛을 재현 탁. 다시 원심 분리기 RT에서 5 분 1,500 XG에와하면 상층 액을 버린다. 새로 제조, 멸균 1X LiAc들을 / TE 1 ㎖에 재현 탁 효모 펠렛. 참고 : 준비 1 시간 이내에 관할 효모 세포를 사용합니다. 200 단일 변환에 대한 플라스미드 DNA의 NG, 0.5 추가 (1.5 ml의 튜브) 플라스미드 샘플을 준비 – 공동 변환에 대한 각각의 플라스미드 DNA 1 μg의, 그리고 청어 고환의 100 μg의 캐리어 DNA를 (20 분간 끓여에 냉각 )를 사용하는 얼음 직전. 참고 : 양성 대조군, 예를 들면 포함, 효모.공동 변환 pVA3 및 pTD1 (SV40 큰 T 항원과 GAL4의 AD 융합 인코딩) (GAL4 DNA-BD의 p53의 단백질과 융합 인코딩)와 함께. 대한 새로 제조, 관할 효모 현탁액 (단계 1.1.8) 100 ㎕ 및 1 배 LiAc들을 / PEG 용액 600 μL (주 8 ml의 PEG 3350, 재고 TE 1 ㎖, 주식 LiAc들을 1 ㎖) 및 와류 추가 ~ 30 초. 200 rpm으로 진탕하면서 30 분 동안 30 ℃에서 인큐베이션. 디메틸 설폭 사이드 (10 % v / V를 최종 농도)의 80 μl를 추가하고 부드러운 반전으로 잘 섞는다. 3 분 – 42 ° C의 물을 욕조에 15 분 동안 열 충격은 매 2를 혼합하면서. 효모를 복구하기 위해 RT에서 15 초 동안 14,000 XG에서 2 분 원심 분리 얼음에 세포 현탁액을 진정. 적절한 최소한의 SD 매체 접시에 재현 탁 세포 1X TE 100 ㎕의 펠렛 및 플레이트 선택적 성장 (중간 모두 미끼와 대상 플라스미드에 선택적 압력을 유지하기 위해 류신과 트립토판이 부족). 최대 사이드 다운 (30)에서 번호판을 품어(- 오일 보통 4) 식민지 직경 ~ 2mm가 될 때까지 C를 °. 플레이트는 2 4 ° C에 저장할 수 있습니다 – 삼주; 더 이상 저장을 위해 -80 ° C에서 글리세롤 주식과 상점을 확인합니다. 참고 : 17 면역 블로 그 미끼 및 대상 단백질이 효모에서 발현되어 있는지 확인하고 (1.3 절에 기술 된 바와 같이 β-갈 분석에 의해) 별도로 효모에서 발현 때 자율적 리포터 유전자의 활성화를하지 않아도. 식민지 리프트 필터 종이 β-갈 분석 다음 버퍼를 준비합니다 100 밀리미터 나 2 HPO 4를 포함하는 Z 버퍼를 준비 40 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 10 밀리미터의 KCl, 1 mM의 황산; 7.4 pH를 조정합니다. 실온에서 고압 증기 멸균 및 저장에 의해 소독. 용해 X 갤런 완충액을 제조 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 β-D-갈 락토 -20 ℃에서 어둠 속에서, N, N 디메틸 포름 아미드 저장소 20 ㎎ / ㎖로. Z 버퍼 / X-걸 솔루션을 준비합니다. 버퍼를 확인Z 버퍼에 0.27 % v / V를에 0.33 ㎎ / ㎖ 및 β-머 캅토 에탄올에서 X-갈 혼합하여 사용하기 전에. 샘플 당 2.5 ml를 사용합니다. 추가 셀룰로오스 종이 필터 내부의 청소 100mm 플레이트와 장소에 갓 준비 Z 버퍼 / X-갈 용액 2.5 ml의. 효모 식민지를 분석 할 수와 판의 표면에 새 필터 종이를 놓습니다. 부드럽게 집게와 함께 접시에 여과지를 문질러 부착 식민지 ~ 5 분 동안 둡니다. 참고 :. 병렬 양성 대조군, 즉, 효모 pVA3 및 pTD1와 공동으로이 형질 전환을 처리합니다. (; 항상 두꺼운 장갑과 고글을 착용 액체 질소 취급시주의해야한다) 여과지를 들어 올리고 30 초 동안 액체 질소의 수영장에 (포셉)를 잠수함. ~ 2 분 동안 실온에서 냉동 필터 종이 해동을 할 수 있습니다. 100 밀리 접시 안에 미리 적신 여과지 위에 여과지 (최대 콜로니 쪽)을 놓고, 30 ℃에서 배양한다. 주기적으로 확인블루 식민지의 모양에 대한 (매 ~ 3​​0 분). 효모 Y190 공동 변환 양성 대조군 플라스미드 (pVA3 + pTD1)과 60 분 (게시되지 않은 관찰) 내에서 파란색으로 바뀝니다. 참고 : 약한 미끼 : 대상의 상호 작용 (장기 배양 거짓 긍정적 인 결과를 제공 할 수 있습니다 (> 8 시간)을 방지) 긍정적 인 푸른 신호를 생성하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면, 즉 갓 공동 변형 식민지를 사용, 4, 30 ° C에서 성장 -. 오일 ~ 직경 2mm입니다. 액체 문화 β-갈 분석 다음 버퍼를 준비합니다 100 밀리미터 나 2 HPO 4를 포함하는 Z 버퍼를 준비 40 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 10 밀리미터의 KCl, 1 mM의 황산; 7.4로 pH를 조정 RT에서 고압 증기 멸균 및 저장에 의해 소독. 1 M 나 2 CO 3; RT에 저장합니다. Z 버퍼 / β-머 캅토 에탄올을 준비합니다. 0.27 %의 V에서 β-머 캅토 에탄올을 첨가하여 사용하는 버퍼 전에 확인 /Z 버퍼의 V; 샘플 당 700 μl를 사용합니다. Z 버퍼 / ONPG 용액을 준비합니다. 이전 버퍼가 Z 버퍼에 v / V를 0.27 %에서 4 ㎎ / ㎖ 및 β-머 캅토 에탄올에 ONPG (오 니트로 페닐-β-D-갈 락토)를 혼합하여 사용할 수 있도록; 샘플 당 160 μl를 사용합니다. 250 rpm으로 진탕 18 시간 – (모두 미끼 및 대상 플라스미드에 선택적 압력을 유지하기 위해 부족 류신과 트립토판), 16 30 ° C에서 품어 최소한의 SD 배지 5 ㎖를 접종하는 하나의 식민지를 사용합니다. 참고 : 분석 다섯 별도의 식민지가 같은 미끼 및 대상 플라스미드로 형질 전환 공동. 0.3 – OD 600 = 0.2를 생산하는 신선한 SD 배지 10 ㎖로 하룻밤 문화의 부족을 전송합니다. 세포 중순 로그 상 (- 0.6 OD 600 = 0.5)가 될 때까지 250 rpm으로 진탕 30 ° C에서 품어. RT에서 2 분 동안 14,000 XG에 1.5 ML 튜브와 원심 분리기로 효모 문화의 0.5 ml에 전송합니다. 세륨을 수확 할 때 정확한 OD 600을 기록LLS. Z 버퍼의 100 ㎕에 재현 탁 펠릿; 이 5 배 집중 계수가 발생합니다. 다음 37 ° C의 물을 욕조에 3 분 해동하는 액체 질소에 넣어 튜브 ~ 1 분 (항상 두꺼운 장갑과 고글을 착용 액체 질소 취급시주의해야한다). 세포가 열려 깨진되도록이 동결 해동주기를 두 번 더 반복합니다. Z 버퍼 100 ㎕와 함께 빈 튜브를 설정합니다. Z 버퍼 / β 머 캅토 에탄올 700 ㎕의 샘플 및 빈 튜브에 Z 버퍼 / ONPG의 160 μl를 추가; 30 ° C 배양기에서 타이머와 장소를 시작합니다. 노란색 개발을 위해 주기적으로 확인합니다. 색상 개발을 중지하고 분 경과 시간을 기록하는 1 M 나 2 CO 3의 400 μl를 추가합니다. 효모 Y190 공동 변환 양성 대조군 플라스미드 (pVA3 + pTD1)로 60 분 이내에 노란색으로 바뀝니다 .. 참고 : 약한 미끼 : 대상의 상호 작용이 가장 재에 대한 긍정적 인 노란색 신호를 생성하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다sults은 갓 공동 형질 콜로니를 사용하여 예 4 30 ℃에서 성장 -. 오일 ~ 2mm 직경. 세포 파편 펠렛 깨끗한 큐벳에 뜨는을 전송하기 위해 RT에서 5 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. 분광 광도계를 사용하여, (- 1.0 0.02 사이 여야 값) 블랭크에 대하여 샘플 (420) 내지 (420)에서의 흡광도를 측정한다. 다음 식에있어서, 오르토 니트로 셀 당 분당 D 갈락토오스 ONPG에 1 μmol을 가수 분해 양으로 정의 1 유닛, β 갈 락토시다 단위 계산 : = β – 갈 락토시다 유닛 여기서 t (분) 배양의 경과 시간; . CF : 단계 1.4.8, 예로부터 집중 계수, CF = 5; OD (600) : 세포를 수확 할 때. 포유 동물 세포 라인 2. 단백질 발현 <st룽> 포유류 세포 형질 다음 미디어와 버퍼를 준비합니다 4.5 g / L의 글루코스, 10 % V / V 소 태아 혈청 및 2 mM L- 글루타민으로 DMEM을 혼합하여 성장 배지를 준비; 4 ℃에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 소독. 280 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을을 혼합하여 2 배 헤 페스 – 완충 식염수 (2 × HBS)를 준비가 1.5mm 나 2 HPO 4, 12 mM의 글루코오스, 50 mM의 헤 페스; , 7.05로 pH를 조정 -20 ° C에서 0.2 ㎛의 필터를 통해 멸균 저장소. -20 ° C에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 2.5 M 염화칼슘 2. 소독을 준비합니다. 형질 전 어느 날, 씨 – 1의 순서로 100mm 페트리 접시에 2 × 10 6 HEK293 세포 60-70 %의 합류는 다음 날이 될 수 있습니다. 5 % CO 2와 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 18 시간 – 16 문화. 형질의 날, 신선한 성장 배지 10 ㎖로 기존의 매체 및 사료 세포를 제거합니다. 노트: 그들은 세포 사멸을 증가시킬 수 있기 때문에 항생제 형질 중에 배지에서 생략된다. 600 μl의 총 부피의 2.5 M CaCl2를 60 μL (공동 형질 감염, 두 플라스미드의 동일한 몰비에 대한) 플라스미드 DNA의 24 μg의 희석 1.5 ML 튜브 내부 (멸균 탈 H 2 O로 만든); 와류 믹스합니다. 참고 :. 높은 형질 전환 효율을 위해, 플라스미드 DNA가 가장 높은 순도, 즉이어야하는 애비 (260) / 애비 (280) 비율 = ~ 1.8 있습니다. 지속적으로 그리고 적극적으로 텍싱하여 혼합하면서 2 배 HBS 600 μl를 포함하는 50 ㎖ 튜브에 현명한 플라스미드 DNA / 칼슘 솔루션 드롭을 추가합니다. 칼슘 포스페이트 / 플라스미드 DNA 복합체를 형성 할 수 있도록 RT에서 20 분 동안 인큐베이션. 그리고 20 분 인큐베이션, 와류 잠시 후 100mm 배양 접시의 표면 전체 영역을 커버하는 셀에 현명한 용액 방울을 추가한다. 5 % CO에서 37 ° C에서 세포를 부화 <sUB> 2. ~ 6 시​​간 후, 배양 배지를 바꾸고 다시 인큐베이터에 놓는다. RT에서 3 분 1,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 24 시간 후 형질을 수확하고 상층 액을 버린다. 필요할 때까지 세포 펠렛은 -80 ° C에서 저장 될 수있다. 참고 : – 72 시간 포스트 형질 발현은 일반적으로 24 봉우리. 셀 균질화 다음 버퍼를 준비합니다 150 mM의 염화나트륨, 20 mM 트리스을 혼합하여 공동 IP 균질화 버퍼를 준비; 7.4 pH를 조정하고 4 ℃에서 저장한다. 5 mM의 헤 페스, 0.3 M 수 크로스를 혼합하여 균질화 완충액 크로스 가교 조제; 7.4 pH를 조정하고 (모든 입자를 제거하기 위해 사용하기 전에 필터) 4 ° C에 저장합니다. 사용 전에 프로테아제 억제제와 보완. 1.5 ML 튜브 내부 – (600 미크론 425) 및 균질화 버퍼의 500 μl를 씻어 유리 구슬 250 μl를 추가합니다. 간단한 원심 분리에 의해 펠렛의 유리 구슬펄스 (5 초 동안 1,000 XG)과 뜨는을 제거합니다. 다시 한번이 세척 단계를 반복합니다. 재현 탁 된 세포를 빙냉 균질화 완충액 500 μL (스텝 2.1.8)에서 펠릿과 유리 비드를 함유하는 튜브에 세포 현탁액을 전송. 1 ML의 주사기에 부착 된 미세 바늘을 통해 20 유로 (23 G, 0.6 X 30mm)에 의해 얼음에 세포를 균질화. 튜브 마개가 바늘 피어스 그것을 통해 폐쇄 및 유리 비드를 통해 격렬히 세포 현탁액으로 분산. 4 ° C에서 10 분 동안 1,500 XG에 원심 분리기는 핵 및 손상되지 않은 세포를 제거하고 펠렛을 삭제합니다. 이후 핵 부분을 나타내는 뜨는을 저장하고 직접하는 공동 IP 또는 크로스 연결 적절를 진행합니다. 3. 시험관 내 생화학 적 방법 공동 면역 침전 다음 버퍼를 준비합니다 (S)에 기재된 공동 IP 균질화 완충액을 준비ection 2.2.1.1. 20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, 0.5 %를 혼합하여 IP 버퍼를 준비한다 (w / v)의 CHAPS, 2 mM의 디티 오 트레이 톨 (선택적, 디티 오 트레이 톨 인해 공기 산화에 형성 할 수있는 단백질 응집체를 줄이기 위해 포함될 수있다); 7.4 pH를 조정하고 4 ℃에서 저장한다. CO-IP 균질화 완충액 브이 CHAPS / w 2 % 준비; 4 ℃에서 저장한다. 60 mM 트리스 / SDS V, 10 % V / 브이 글리세롤, 5 mM의 EDTA, 0.01 % 파란색 V의 브로 모 페놀 / w, 2 % V / V의 β-머 캅토 에탄올 (옵션) w 2 %를 혼합하여 단백질 로딩 버퍼를 준비; RT에서 6.8 pH와 저장소를 조정합니다. 합류 100mm 배양 접시에서 세포를 균질화 (~ 8 × 106 세포 혈구를 이용하여 계산 HEK293, 경우) 2.2 절에 기술 된 바와 같이. 일정한 혼합 4 ° C에서 ≥2 시간 동안 후 핵 서브 셀룰러 0.5 % CHAPS와 비율 (2 %의 주식을 사용) 및 배양을 용해. 4 ° C에서 10 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기 불용성 materi를 펠렛알와 펠렛을 폐기합니다. 뜨는 불리는 세포 용 해물을 저장합니다. 주 : 세제 불용성 물질의 제거의 포함은 비특이적 결합을 최소화하기 위해 절대적으로 필요하다. . 중간체 세제, 예컨대, CHAPS 또는 트리톤 X-100, 0.2의 농도 – 1 %, 가장 일반적으로 사용된다. 6 ㎎ / ㎖ 단백질 A 또는 단백질 G 아가로 오스 (또는 파로스) 비드 (IgG에 결합 용량에 따라) 두 개의 1.5 ml의 튜브를 준비하고 ~ 20 μl를 추가합니다. IP 버퍼의 200 μl를 씻으시오. 참고 : immunoprecipitating 항체를 제기하는 데 사용되는 동물 종에 따라 적절한 IG 결합 수지를 선택합니다. 단백질 G는 단백질-A에 비해 IG 서브 타입의 넓은 범위를 결합한다. 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 구슬을 복구 할 수 있습니다. 한 번 더 IP 버퍼와 반복 세척 한 다음 IP 버퍼 200 μL에 비즈를 재현 탁. 에합니다 (immunoprecipitating 항체 또는 비 면역 IgG를 1 μg의 (5 NG / μL)를 추가두 개의 분리 된 단백질 A / G 들어있는 튜브에 부정적인 제어) 역할을한다. 일정한 혼합 4 ° C에서 ≥2 시간 동안 품어. 참고 : 항상 immunoprecipitating 항체와 같은 동물 종에서 제기 비 면역의 IgG의 사용과 음성 대조군을 처리합니다. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 구슬을 복구 조심스럽게 피펫으로 상층 액을 버린다. 항체 및 단백질 A / G 구슬 두 튜브의 각으로 (단계 3.1.3에서) 세포 용 해물의 200 μl를 전송합니다. 항원 – 항체 결합을 허용하는 일정한 혼합하여 4 ° C에서 ≥2 시간 동안 품어. 구슬 복구 및 IP 버퍼의 200 μl를 씻어; 혼합으로 4 ° C에서 10 분 동안 배양한다. (특정 및 비 특이 적 결합을 모두 줄일 여러 세척을 방지) 구슬을 복구하고 두 번 더 씻는다. 조심스럽게 피펫으로 상층 액을 버린다. immunoprecipit 용출 단백질 로딩 버퍼의 30 μl를 추가ated 단백질. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 원심 분리기, 구슬을 무시하고 용출 공동 IP 샘플을 포함 뜨는을 저장합니다. 성공적인 단백질 X 침전을 확인하기 위해, 분취 량을 포함 단백질 X. 특이 항체 17 발현 수준에서 분석하는 SDS-PAGE 겔상에서 공동 IP 샘플 소량 (1/10 번째 3 μL)을로드 세포 용 해물은 샘플의 단백질 X의 발현을 확인합니다. 별도의 SDS-PAGE 겔상에서 공동 IP 샘플의 나머지 (9/10 번째, 27 μL)를로드 공침 단백질 Y의 존재를 테스트하는 단백질 Y. 특이 항체 17 발현 수준으로 분석 할 샘플 Y 단백질 발현을 확인하기 위해 세포 용 해물의 분취 량을 포함한다. 화학적 가교 결합 다음 버퍼를 준비합니다 섹션 2.2.1.1에 기재된 균질화 완충액 가교. 5 배 쪽을 준비rotein 로딩 버퍼 300 mM 트리스 / SDS V, 50 % V / 브이 글리세롤, 25 mM의 EDTA, 0.05 % 파란색 V의 브로 모 페놀 / w, 10 % V / V의 β-머 캅토 에탄올 (옵션) w 10 %를 혼합하여; RT에서 6.8 pH 및 저장을 조절; 사용하기 전에 50 ° C에서 따뜻한. 합류 100mm 배양 접시에서 세포를 균질화 (~ 8 × 106 세포 혈구를 이용하여 계산 HEK293, 경우) 2.2 절에 기술 된 바와 같이. 참고 : 자당은 (0.3M에서)는 삼투압 버퍼를 만드는 데 사용됩니다. 염, 예를 들면, 120-150 mM의 염화나트륨의 KCl 또는 관심 올리고머 단백질 복합체에 따라 대신에 사용될 수있다. 단백질 집계를 펠렛과 뜨는을 저장 4 ° C에서 10 분 동안 20,000 XG에서 후 핵 이하 세포질 부분을 원심 분리기. 별도의 0.5 ml의 튜브에 (일반적으로 단백질 ~ 20 μg의) 20 μl를 각의 팔 분취 량을 가져 가라. 모든 샘플에 0.0025 % V / V의 글루 타르 알데히드를 추가하고 타이머를 시작합니다. 여덟 샘플 각각 glutarald 반응하자실온에서 ehyde : 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 분. 참고 : 글루 타르 알데히드 무료 아민과 반응이 알데히드 그룹을 보유하고 있습니다. 그들은 글루 타르 알데히드 반응을 해소하기 때문에 pH 완충제 또는 기본 아미노 그룹과 다른 물질을 사용하지 마십시오. 2 % v / V를 히드라진과 지정된 시간에 글루 타르 알데히드 반응을 중지하고 단백질을 변성 5 배 단백질 로딩 버퍼의 5 μl를 추가합니다. SDS-PAGE 및 면역 (17)에 진행합니다.