Approches génétiques et biochimiques pour<em> In Vivo</em> et<em> In vitro</em> Évaluation de Protein oligomérisation: Étude de cas Ryanodine Receptor

1. La levure à deux hybrides Yeast transformation Préparer les médias et les tampons suivants: Préparer la levure complète (YPD) un milieu d'extrait de levure-peptone-dextrose en mélangeant 20 g / L de peptone, 10 g / L d'extrait de levure, 2% p / v de glucose (ajoutée après autoclavage) et 20 g / l d'agar (pour des plaques uniquement) ; stériliser à l'autoclave et en utilisant fraîches le jour de l'expérience. Préparer une levure synthétique minimale définie (SD) moyenne (dépourvu de leucine et de tryptophane pour maintenir une pression sélective sur les deux plasmides appât et cible) en mélangeant 6,7 g / l de base azotée de levure, 1,6 g / L de chute de tension supplément dépourvu de leucine et de tryptophane, 2% en poids / v de glucose (ajoutée après autoclavage) et 20 g / l d'agar (pour les plaques seulement); stériliser à l'autoclave et en utilisant fraîches le jour de l'expérience. Préparer 50% p / v de PEG (polyéthylène glycol) 3350; stériliser à travers un filtre de 0,2 um et stocker à température ambiante. Préparer mM Tris / EDTA 10 mM (10x TE) 100, réglezle pH à 7,5, stériliser à travers un filtre de 0,2 um et stocker à température ambiante. Préparer 1 M d'acétate de lithium (10x LiAc); ajuster le pH à 7,5 avec CH3COOH, stériliser à travers un filtre de 0,2 um et stocker à température ambiante. Revive la souche Y2H (par exemple, Y190) en striant une petite quantité du stock de glycérol congelé sur une plaque YPD. Incuber à 30 ° C jusqu'à ce que des colonies de levures atteignent ~ 2 mm de diamètre (généralement 3 – 5 jours, en fonction de la souche de levure). Inoculer 0,5 ml de milieu YPD (dans un tube de 1,5 ml) avec un seul grand (2 – 3 mm de diamètre) colonie. Vortexer vigoureusement pendant environ 2 minutes pour disperser les grumeaux. Transférer la suspension de cellules dans un flacon de 500 ml contenant 50 ml de milieu YPD. Incuber à 30 ° C pendant 16 – 18 h sous agitation à 250 tours par minute pour la levure pour atteindre la phase stationnaire. Transfert 4 – 5 ml de la culture pendant une nuit dans 200 ml de YPD (dans un erlenmeyer de 1 litre) pour produire une densité optique à 600 nm (DO 600, mesuréen utilisant un spectrophotomètre) de 0,2 – 0,3 (200 ml sera suffisant pour 20 transformations). Incuber à 30 ° C sous agitation à 250 tpm jusqu'à ce que les cellules sont en phase mid-log, soit DO600 = 0,5 à 0,6 (généralement 2 – 3 h). Récolte de la levure par centrifugation (en tubes de 50 ml) à 1 500 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant, resuspendre chaque culot dans 5 ml de H 2 O stérile et la piscine ensemble. Re-centrifugeuse à 1500 xg pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant. Resuspendre le culot de levure dans 1 ml de fraîchement préparée, 1x stérile LiAc / TE. REMARQUE: Utiliser des cellules de levure compétentes dans 1 heure de préparation. Préparer des échantillons de plasmide (en tubes de 1,5 ml) par addition de 200 ng d'ADN de plasmide pour des transformations simples, ou 0,5 à 1 ug de chaque ADN de plasmide pour les co-transformation, et 100 ug de testicules de hareng ADN porteur (bouillie pendant 20 minutes et refroidi sur de la glace juste avant l'utilisation). NOTE: Inclure un contrôle positif, par exemple, la levure.co-transformée avec pVA3 (codant pour l'ADN de GAL4 BD fusion avec la protéine p53) et pTD1 (codant pour GAL4 AD fusion avec l'antigène T de SV40). Ajouter 100 pi de la suspension de levure compétente fraîchement préparée (étape 1.1.8) et 600 pi de solution 1x LiAc / PEG (8 ml de bouillon de PEG 3350, 1 ml de stock TE, 1 ml de stock LiAc) et vortex pour la ~ 30 sec. Incuber à 30 ° C pendant 30 min avec agitation par secousses à 200 tours par minute. Ajouter 80 ul de diméthylsulfoxyde (10% v / v concentration finale) et bien mélanger par inversion douce. Le choc thermique pendant 15 min dans un bain d'eau C 42 ° tout en mélangeant tous les 2 – 3 min. Réfrigérer suspension de cellules sur la glace pendant 2 min et centrifuger à 14 000 xg pendant 15 secondes à la température ambiante pour récupérer la levure. Resuspendre le culot cellulaire dans 100 pi de 1 x TE et on plaque sur des plaques de milieu minimal SD appropriées pour la croissance sélective (milieu dépourvu de leucine et de tryptophane pour maintenir une pression sélective sur les deux plasmides appât et de la cible). Incuber les plaques up-side-down à 30° C jusqu'à ce que les colonies sont ~ 2 mm de diamètre (habituellement 4 – 5 jours). Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant 2 – 3 semaines; pour plus de stockage faire des stocks de glycérol et conserver à -80 ° C. REMARQUE: Vérifiez que les protéines appâts et cibles sont exprimées dans la levure par immunotransfert 17, et qu'ils n'ont pas l' activation du gène rapporteur autonome lorsqu'il est exprimé séparément dans la levure (par dosage β-Gal comme décrit dans la section 1.3). Colony-lift β-Gal Filter Paper Assay Préparer les tampons suivants: Préparer un tampon Z contenant 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM de KCl, 1 mM MgSO 4; ajuster le pH à 7,4. Stériliser par autoclavage et conserver à la température ambiante. Préparer tampon X-Gal en dissolvant 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside à 20 mg / ml dans le N, N-diméthylformamide et stocker dans l'obscurité à -20 ° C. Préparer le tampon Z / solution X-Gal. Faire tamponavant l'emploi en mélangeant le X-Gal à 0,33 mg / ml et β-mercaptoéthanol à 0,27% v / v dans du tampon Z. Utiliser 2,5 ml par échantillon. Ajouter 2,5 ml de solution fraîchement préparée tampon Z / X-Gal dans une plaque de 100 mm propre et place à l'intérieur d'un papier filtre de cellulose. Placez un nouveau papier filtre sur la surface de la plaque avec les colonies de levure à doser. Frottez doucement le papier filtre sur la plaque avec des pinces et laisser reposer pendant environ 5 min pour les colonies pour attacher. NOTE: Traiter le contrôle positif en parallèle, à savoir, la levure co-transformée avec pVA3 et pTD1.. Soulevez le papier filtre et le plonger (avec une pince) dans une piscine de l'azote liquide pendant 30 sec (azote liquide doit être manipulé avec précaution, toujours porter des gants épais et des lunettes). Laissez le dégel du papier filtre congelé à la température ambiante pendant environ 2 min. Placez le papier filtre (côté de la colonie vers le haut) sur le dessus du papier pré-imprégné filtre à l'intérieur de la plaque 100 mm, et incuber à 30 ° C. Vérifiez périodiquement(Tous les ~ 30 min) pour l'apparition de colonies bleues. La levure Y190 co-transformé avec les plasmides de contrôle positif (+ pVA3 pTD1) devient bleu à moins de 60 min (observations non publiées). REMARQUE: l'appât faible: interactions cibles peuvent prendre plusieurs heures pour produire un signal bleu positif (éviter une incubation prolongée (> 8 h) qui peuvent donner des résultats faussement positifs). Pour de meilleurs résultats, utilisez des colonies fraîchement co-transformées, à savoir, cultivé à 30 ° C pendant 4 – 5. Jours ~ 2 mm de diamètre. Β-Gal Liquid Culture Assay Préparer les tampons suivants: Préparer un tampon Z contenant 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM de KCl, 1 mM MgSO 4; ajuster le pH à 7,4, stériliser à l'autoclave et conserver à la température ambiante. 1 M de Na 2 CO 3; stocker à température ambiante. Préparer Z buffer / β-mercaptoéthanol. Faire un tampon avant d'utiliser en ajoutant β-mercaptoéthanol à 0,27% v /v dans du tampon Z; utiliser 700 ul par échantillon. Préparer Z tampon / solution ONPG. Assurez-tampon avant l'utilisation par mélange d'ONPG (o-nitrophényl-β-D-galactopyranoside) à 4 mg / ml et β-mercaptoéthanol à 0,27% v / v dans du tampon Z; utiliser 160 ul par échantillon. Utilisez une seule colonie pour inoculer 5 ml de milieu SD minimal (dépourvu de leucine et de tryptophane pour maintenir la pression sélective sur les deux plasmides d'appât et cible) et incuber à 30 ° C pendant 16 – 18 h avec agitation à 250 tours par minute. NOTE: Assay cinq colonies distinctes co-transformées avec les mêmes appâts et cible plasmides. Transfert assez de la culture de la nuit dans 10 ml de milieu SD douce pour produire une DO 600 = 0,2 à 0,3. Incuber à 30 ° C sous agitation à 250 tpm jusqu'à ce que les cellules sont en phase semi-logarithmique (DO600 = 0,5 à 0,6). Transférer 0,5 ml de culture de levure dans un tube de 1,5 ml et on centrifuge à 14 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Notez la DO exacte 600 lors de la récolte de la CElls. Resuspendre le culot dans 100 pi de tampon de Z; cela se traduira par un facteur de concentration de 5 fois. Placer le tube dans de l'azote liquide pour ~ 1 min (azote liquide doit être manipulé avec précaution, toujours porter des gants épais et des lunettes), puis dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 3 min à décongeler. Répétez ce cycle gel-dégel deux fois plus pour assurer les cellules sont brisées ouvertes. Mise en place d'un tube vide avec 100 pi de tampon Z. Ajouter 700 pi de tampon Z / β-mercaptoéthanol et 160 pi de tampon Z / ONPG à l'échantillon et des tubes vides; démarrer la minuterie et le placer dans un incubateur à 30 °. Vérifiez périodiquement pour la couleur jaune de se développer. Ajouter 400 pi de 1 M Na 2 CO 3 pour arrêter le développement de la couleur et enregistrer le temps écoulé en minutes. Levure Y190 co-transformée avec les plasmides témoins positifs (+ pVA3 pTD1) devient jaune dans les 60 min .. REMARQUE: l'appât faible: interactions cibles peuvent prendre plusieurs heures pour produire un signal positif jaune Pour obtenir de meilleurssultats, utiliser des colonies fraîchement co-transformées, soit cultivé à 30 ° C pendant 4. – 5 jours, ~ 2 mm de diamètre. Centrifuger à 14000 xg pendant 5 min à température ambiante pour sédimenter les débris cellulaires et transférer le surnageant dans une cuvette propre. L' utilisation d' un spectrophotomètre, mesurer l'absorbance à 420 nm (A 420) des échantillons par rapport à l'ébauche (valeurs doit être comprise entre 0,02 à 1,0). Calculer les unités de β-galactosidase, avec une unité définie comme la quantité qui hydrolyse 1 umole d'ONPG à l'o-nitrophénol et le D-galactose par min par cellule, selon la formule suivante: = unités β-galactosidase Où: t: temps d'incubation écoulé (en minutes); . cf: le facteur de concentration de l' étape 1.4.8, c. -à- CF = 5; OD 600: lorsque les cellules ont été récoltées. 2. Expression de la protéine dans une lignée cellulaire mammalienne <strong> Mammalian Transfection cellulaire Préparer les médias et les tampons suivants: Préparer un milieu de croissance en mélangeant du DMEM avec 4,5 g / L de glucose, 10% en v v de sérum bovin fœtal / et 2 mM de L-glutamine; stériliser à travers un filtre et un magasin de 0,2 um à 4 ° C. Préparer une solution saline 2x Hepes tamponné (2x HBS) en mélangeant NaCl 280 mM, KCl 10 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 12 mM de glucose, 50 mM Hepes; ajuster le pH à 7,05, stériliser à travers un filtre et un magasin de 0,2 um à -20 ° C. Préparer 2,5 M CaCl 2. Stériliser à travers un filtre et un magasin de 0,2 um à -20 ° C. Un jour avant la transfection, les graines 1 – 2 x 10 6 cellules HEK293 dans un plat de 100 mm de Pétri pour être 60-70% de confluence le jour suivant. Culture pendant 16 – 18 heures à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. Le jour de la transfection, enlever les vieilles cellules moyennes et aliments pour animaux avec 10 ml de milieu de croissance frais. REMARQUELes antibiotiques sont omis dans le milieu de culture pendant la transfection parce qu'ils peuvent augmenter la mort cellulaire. Diluer 24 pg d'ADN de plasmide (par co-transfection, un rapport molaire égal des deux plasmides) et 60 ul de 2,5 M de CaCl2 dans 600 ul de volume total ( à base de l' eau désionisée stérile 2 O) à l' intérieur d' un tube de 1,5 ml; vortex pour mélanger. NOTE:. Pour une efficacité maximale de transfection, l' ADN plasmidique doit être de la plus grande pureté, à savoir, avoir un ratio = ~ 1,8 Abs 260 / Abs 280. Ajouter la goutte de solution d'ADN plasmidique / calcium sage dans un tube de 50 ml contenant 600 ul de HBS 2x tout en mélangeant continuellement et vigoureusement par tourbillonnement. Incuber pendant 20 min à température ambiante pour permettre la formation de complexes d'ADN / phosphate de calcium plasmide. Après la 20 minutes d'incubation, vortex brièvement et ajouter goutte à la solution sage sur les cellules pour couvrir toute la surface de la boîte de Petri 100 mm. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO <sub> 2. Après ~ 6 h changer le milieu de croissance et placer dans l'incubateur. Récolter les cellules 24 heures après la transfection par centrifugation à 1000 g pendant 3 min à température ambiante et jeter le surnageant. Les culots cellulaires peuvent être conservés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation. NOTE: L'expression culmine généralement 24-72 heures après la transfection. cellule Homogénéisation Préparer les tampons suivants: Préparer un tampon d'homogénéisation co-IP par mélange NaCl 150 mM, Tris 20 mM; ajuster le pH à 7,4 et stocker à 4 ° C. Préparer réticulation tampon d'homogénéisation par mélange Hepes 5, 0,3 M de saccharose; ajuster le pH à 7,4 et stocker à 4 ° C (filtre avant de l'utiliser pour éliminer toutes les particules). Supplément avec des inhibiteurs de la protéase avant utilisation. Ajouter 250 ul de billes de verre (425 – 600 microns) dans un tube de 1,5 ml et on lave avec 500 pi de tampon d'homogénéisation. perles de verre à pellets par une brève centrifugationimpulsion (1000 xg pendant 5 sec) et retirer le surnageant. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Resuspendre le culot cellulaire (étape 2.1.8) dans 500 ul de tampon d'homogénéisation refroidi à la glace et à transférer la suspension cellulaire dans le tube de perles de verre contenant. Homogénéiser les cellules sur la glace par 20 passages à travers une aiguille fine (23 G, 0,6 x 30 mm) attachés à une seringue de 1 ml. Avec le bouchon du tube fermé, percer avec l'aiguille et disperser la suspension cellulaire vigoureusement à travers les perles de verre. Centrifuger à 1500 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les noyaux et les cellules non rompues et jeter le culot. Enregistrez le surnageant représentant la fraction post-nucléaire et procéder directement à la co-IP ou de réticulation, le cas échéant. 3. in vitro Méthodes biochimiques Co-immunoprécipitation Préparer les tampons suivants: Préparer tampon d'homogénéisation Co-IP comme décrit dans section 2.2.1.1. Préparer un tampon IP en mélangeant du Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 0,5% (p / v) de CHAPS, 2 mM de dithiothréitol (facultatif; dithiothréitol peut être inclus pour réduire les agrégats de protéines qui se sont formées par oxydation à l'air); ajuster le pH à 7,4 et stocker à 4 ° C. Préparer 2% p / v de CHAPS dans un tampon d'homogénéisation co-PI; stocker à 4 ° C. Préparer un tampon de chargement de protéine en mélangeant du Tris 60 mM, 2% p / v de SDS, 10% v / v de glycérol, 5 mM d'EDTA, 0,01% p / v de bleu de bromophénol, 2% v / v β-mercaptoéthanol (facultatif); ajuster le pH à 6,8 et conserver à la température ambiante. Homogénéiser les cellules d'un mm plat confluentes 100 Petri (~ 8 x 10 6 cellules HEK293 si, compté avec l'utilisation d'un hémocytomètre) tel que décrit à la section 2.2. Solubiliser la fraction sub-cellulaire post-nucléaire avec 0,5% de CHAPS (en utilisant 2% stock) et incubation pendant ≥2 heures à 4 ° C avec un mélange constant. Centrifuger à 20 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter les materi insolubleal et jeter le culot. Enregistrez le surnageant appelé lysat cellulaire. NOTE: L'inclusion d'un détergent et d'élimination de la matière insoluble est absolument nécessaire pour réduire au minimum la liaison non spécifique. . Détergents intermédiaires, par exemple, CHAPS ou Triton X-100, à une concentration de 0,2 à 1%, sont les plus couramment utilisés. Préparer deux tubes séparés de 1,5 ml et ajouter 20 pl ~ (selon la capacité de liaison à l'IgG) de 6 mg / ml de protéine A ou de protéine G-agarose (Sepharose) ou des billes. Laver avec 200 pi de tampon IP. REMARQUE: Choisissez la résine appropriée Ig de liaison en fonction des espèces animales utilisées pour élever l'anticorps immunoprécipitation. Protein-G se lie à un plus large éventail de sous-types d'Ig par rapport à la protéine-A. Récupérer des perles par centrifugation à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Répétez lavage une fois de plus avec un tampon IP, puis remettre en suspension des billes dans 200 pi de tampon IP. Ajouter 1 pg (5 ng / ul) de l'anticorps immunoprécipitation ou IgG non immune (àservir de témoin négatif) dans les / G tubes contenant deux Protein-A séparé. Incuber pendant ≥2 heures à 4 ° C avec mélange constant. NOTE: Toujours traiter un contrôle négatif avec l'utilisation d'IgG non-immune élevés dans les mêmes espèces animales que l'anticorps immunoprécipitation. Récupérer des perles par centrifugation à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C et jeter soigneusement le surnageant par pipetage. Transférer 200 pi de lysat cellulaire (étape 3.1.3) dans chacun des deux tubes avec les anticorps et la protéine A / G perles. Incuber pendant ≥2 heures à 4 ° C avec mélange constant pour permettre la liaison antigène-anticorps. Récupérer des perles et laver avec 200 pi de tampon IP; laisser incuber pendant 10 min à 4 ° C tout en mélangeant. Récupérer des perles et laver deux fois plus (éviter de multiples lavages qui permettra de réduire à la fois la non-spécifique spécifique et obligatoire). jetez soigneusement le surnageant par pipetage. Ajouter 30 pi de tampon de protéine de chargement pour éluer immunoprecipitprotéines ATED. Centrifugeuse à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C, jeter les perles et enregistrer le surnageant contenant l'échantillon co-IP élue. Pour vérifier la réussite protéine X précipitations, charger une petite quantité (1/10 ème, 3 pi) de l'échantillon co-IP sur un gel SDS-PAGE à analyser par immunotransfert 17 avec un anticorps spécifique pour la protéine X. Inclure une aliquote de la lysat cellulaire pour vérifier la protéine X expression dans votre échantillon. Pour tester la présence d' une protéine co-précipité Y, charger le reste (10/09 ème, 27 pi) de l'échantillon de co-IP sur un gel SDS-PAGE séparée pour être analysé par immunotransfert avec un anticorps 17 spécifique pour la protéine Y. Inclure une aliquote du lysat cellulaire pour vérifier la protéine Y expression dans votre échantillon. Réticulation chimique Préparer les tampons suivants: Cross-linking tampon d'homogénéisation tel que décrit dans la section 2.2.1.1. Préparer p 5xrotein tampon de chargement en mélangeant 300 mM de Tris, 10% p / v de SDS, 50% v / v de glycerol, 25 mM d'EDTA, 0,05% p / v de bleu de bromophénol, 10% v / v β-mercaptoéthanol (facultatif); ajuster le pH à 6,8 et conserver à la température ambiante; chaude à 50 ° C avant utilisation. Homogénéiser les cellules d'un mm plat confluentes 100 Petri (~ 8 x 10 6 cellules HEK293 si, compté avec l'utilisation d'un hémocytomètre) tel que décrit à la section 2.2. NOTE: sucrose (à 0,3M) est utilisé pour créer un tampon iso-osmotique. Sel, par exemple, 120 – 150 mM de NaCl ou de KCl peut être utilisé à la place, en fonction du complexe de protéine oligomérique d'intérêt. Centrifuger la fraction sub-cellulaire post-nucléaire à 20 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter les agrégats de protéines et de récupérer le surnageant. Prenez huit aliquotes de 20 ul chacune (typiquement ~ 20 ug de protéines) dans 0,5 ml tubes séparés. Ajouter 0,0025% v / v glutaraldéhyde à tous les échantillons et démarrer la minuterie. Que chacun des huit échantillons réagissent avec glutaraldehyde à température ambiante pendant 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min. REMARQUE: Glutaraldéhyde a deux groupes aldéhydes qui réagissent avec les amines libres. Évitez d'utiliser des tampons de pH ou d'autres substances avec des groupes amino primaires, car ils étancher la réaction de glutaraldéhyde. Arrêter la réaction de glutaraldéhyde à l'heure spécifiée avec 2% v / v hydrazine et ajouter 5 pi de tampon de protéine de chargement 5x pour dénaturer les protéines. Passez à SDS-PAGE et immunoblotting 17.