リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

1. HUVEC文化とメンテナンス （詳細については、マテリアル/機器のリストを参照）フェノールレッドフリー内皮基礎培地を内皮細胞増殖培地サプリメントのパッケージと5％のペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質混合物の全体の内容を追加することにより、完全な内皮基礎培地を準備します。水浴中で37°Cまでのウォーム完全な内皮基礎培地。 液体窒素保存から1 HUVECのクライオバイアルを外し、2分間37℃の水浴中で急速に解凍。 〜80から90パーセントを解凍すると、クライオバイアルに温め完全な内皮基礎培地500μlを追加し、ピペッティングにより混和し、温め完全内皮基礎培地15 mlを含む100ミリメートルのプラスチック組織培養皿に細胞を均一に分配します。 5％CO 2で37℃のインキュベーターに入れる細胞。細胞は一晩接着させます。細胞培養培地を削除するか、変更しないでください。 100mMの皿は、> 90％コンフルエントのときに、HUVECをIを転送しますそして75cm 2の組織培養処理フラスコNTO常時60>での％コンフルエンスを維持する（ステップ1.5を参照してください）。 注：密度> 60％で維持した場合、HUVEC倍加時間が一貫して18から20時間です。 細胞を継代する必要がない状況（ すなわち、密度が<90％である）のために、培地を吸引し、新鮮な完全内皮基礎培地で48時間ごとに交換してください。 時のHUVECリーチ> 90％のコンフルエンス、1×PBS 10mlで2回すすぎ、その後、それらを37℃で1〜2分間、0.25％トリプシン1.5mlを処理することにより、組織培養皿から細胞を除去します。注：HUVECの生存率を大幅にトリプシン曝露の長さを延長することによって低減されます。 4の割合でトリプシン/ HUVEC混合物に8.5ミリリットルの完全内皮基礎培地を加えることによってレスキュー細胞：1内皮基礎培地の完全な：トリプシン（最小限の比率）、および15ミリリットルコニカルチューブに集めます。 4分間の1400×gで遠心分離します。吸引物上清。 完全な内皮基礎培地2mlにペレットを再懸濁し、完全な内皮基礎培地25mlを含む新しい225センチメートル2組織培養フラスコに細胞を追加します。 前HUVEC文化2.カバースリップの準備フィブロネクチン基質でコーティングカバーガラス。 100％エタノール中で室温（RT）できしむクリーン22ミリメートル番号1.5カバースリップ39とストアを準備します。 カバーガラスを火炎とピンセットを用いて、35mmのペトリ皿にそれを置くためにブンゼンバーナーを使用してください。 PBSの990μlのフィブロネクチン株式の10μlの（1mg / ml）を混合することによって、フィブロネクチン/ PBS混合物を準備します。 ピペット35mm皿でカバーガラス上にフィブロネクチン/ PBS混合物250μlの。カバーガラスの表面を覆うように均一に広げます。 37℃で3時間の最小値のための皿をインキュベートし、使用前に1×PBSの2ミリリットルで3回すすいでください。 <li>ポリアクリルアミド（PA）基質でコーティングしたカバー。 カバーガラスのアクティベーション撹拌プレート上で10分間、50％3-aminopropyltrimethyloxysilaneに22ミリメートル番号1.5カバースリップを置きます。インキュベーション後、各2分間10回洗浄し、二重蒸留H 2 O（のddH 2 O）。 撹拌プレート上で30分間、0.5％グルタルアルデヒド中でカバースリップをインキュベートします。インキュベーションの後、のddH 2 Oで2分間、10回洗浄ポリアクリルアミドの準備 40％アクリルアミド3.75 mlの2％のビス-アクリルアミドを0.3mlとのddH 2 Oを0.95 mlで添加することにより0.7キロパスカル（kPaで）の遵守PAゲルを準備過硫酸アンモニウム（APS）の10％ワーキング溶液を調製し、使用するまで氷上で保管。 ddH 2 Oの0.83μlの、ビスアクリルアミド溶液を41.7μlを添加、1カバーガラス（総容量= 166.7マイクロリットル）のためのPA溶液を調製するには、10％のAPSの124μLを（ステップ2.2.2.1製）、およびTEMEDの0.25μlの。 すぐに疎水性のスライドガラス上にPA液の15μLをピペット（試薬リストを参照してください）​​および活性化22ミリメートル番号1.5カバースリップでカバーしています。 PAは、RTで20分間重合させました。 カバースリップを外し、35mmの皿に移します。 1×PBSの2ミリリットルで3回洗浄します。 4°Cで<2週間保管してください。 ポリアクリルアミドゲルにフィブロネクチンをバインドするには、UV光の7500 J（254nmの）と2 mMのスルホ – SANPAHにポリアクリルアミドでコーティングされたカバースリップを公開します。 ddH 2 Oで一回すすぎ PBSの990μlのフィブロネクチン株式の10μlの（1mg / ml）を混合することによって、フィブロネクチン/ PBS混合物を準備します。 ピペット35ミリメートルのペトリ皿中のカバースリップ（複数可）へのフィブロネクチン/ PBS混合物250μlの。カバーガラスの表面を覆うように均一に広げます。 37℃で3時間の最小値のための皿をインキュベートし、使用前に1×PBSの2ミリリットルで3回すすいでください。 <pクラス= "jove_title"> 3。カバースリップ上のcDNAをトランスフェクション及びHUVEC文化完全な手順1.5から1.6まで。 血球計数器を使用して、細胞数をカウントし、100,000個の細胞（非遊走実験用）/カバースリップまたは500,000個の細胞（遊走実験用）/カバースリップを含むボリュームを収集します。 4分間の1400×gで遠心分離によって細胞をペレット。 注：移行プロトコルは、セクション9に記載され、以下に。 再懸濁細胞を、100μlのエレクトロポレーション緩衝液を用いてトランスフェクトします。 1μgのcDNAと結合し、エレクトロポレーションキュベットに入れます。エレクトロポレーション細胞：HUVECのエレクトロポレーション（：-034、例えばプログラム番号）に指定されたプログラムを用いてDNA混合物。 レスキューは（上記、プロトコル2.1を参照）、フィブロネクチンでコーティングした22ミリメートル番号1.5カバースリップ上に500μlの完全な内皮基礎培地とプレートの細胞で細胞を​​トランスフェクトしました。 cDNA構築物の発現のための時間を可能にするために3-4時間、37℃でインキュベートします。 イメージングのための試料のル "> 4。準備 2.5センチメートルのx 0.65センチメートルのストリップに両面テープをカットします。 清浄なスライドガラスを得ます。両面テープの2つのストリップを取り、スライドの上部と下部の縁に沿って水平に固定します。注：ステップ4.5）に記載したように、チャンバをシールするためのテープとスライドエッジとの間の空間の少量を可能にするために重要です。 テープ上のカバーガラスの残りの2辺となるよう、（セルサイドダウンステップ3.4から）マウントカバースリップ。カバースリップを確保するためにそっと押すように鉗子を使用してください。 マイクロピペットを用いて、カバーガラスとスライドとの間イメージング媒体40μlの（25μMHEPESを補充した完全内皮基礎培地）を追加します。カバースリップとスライドの間に空間が完全に画像媒体で満たされていることを確認してください。吸引し過剰イメージング媒体（必要な場合）。 暖かいVALAP（：1：1ワセリン：ラノリン：パラフィン1）ですべてのエッジを封印。 gentlを押して漏れをチェックカバーガラス上のy。 予め温めた（37℃）顕微鏡ステージ上に搭載され、密封されたカバーガラスを配置します。 5.顕微鏡 60X、1.40開口数（NA）微分干渉コントラスト（DIC）油浸対物レンズ、自動焦点監視システム（PFS）、透過照明用の電子シャッターを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて、X-及び-Yは、モータリングステージ、電子フィルタホイール内に収容されたバンドパスフィルタ、およびモノリシックレーザコンバイナモジュールは、細胞/カバーガラスの界面で顕微鏡を集中し、1つのセルを配置するために顕微鏡ステージのジョイスティックを使用しています。 画像ソフトウェアプログラムの「カメラ設定」パネルをクリックします。カメラの設定パネルの「露光時間」ドロップダウンウィンドウ内では、400ミリ秒を選択します。 注：露光時間は変更になる場合があり、経験的に決定されるべきです。 で「ND取得」パネルをクリックします。画像ソフトウェアプログラム。 ND取得パネルのラムダ（λ）タブ内では、488と561 nmのレーザーを選択するには、チェックボックスをクリックしてください。 ND取得パネルの「時間」タブ内には、2秒と2分の合計時間に取得時間を設定します。 両方の488と561 nmの照明のために400ミリ秒の露光時間を使用して、2秒の取得間隔で2分のタイムラプス画像シーケンスを取得するためにND取得パネル内の「今すぐ実行」ボタンをクリックします。 画像ソフトウェアプログラムの「光学構成」パネルで、ステップ5.2で説明したカメラの設定を使用して、405 nmのレーザーボタンをクリックし、青色蛍光タンパク質（BFP）の単一のイメージをキャプチャする」を取得」をクリックして、タンパク質を標識。 注：この波長は時間をかけて細胞を損傷することができますように、405 nmレーザー照射への細胞の曝露（画像キャプチャおよび/または露光時間の頻度）を制限することが一般的にお勧めします。 MCAK-shRNAの研究のために、BFP標識されたshRNAの発現を確認するために、単一の405 nmの画像をcquire。 画像ソフトウェアプログラムの「光学構成」パネルではと形態解析を分岐するための細胞の単一DICイメージをキャプチャするために、「取得」をクリックしDIC]ボタンをクリックすると、ステップ5.2で説明したカメラの設定を使用して（セクション10を参照してください、下記）。 画像取得に続いて、デジタル的に画像信号を増加させるために画像ソフトウェアプログラムで「明るさ/コントラスト」機能を使用します。 明るさとコントラスト調整画像をエクスポートします。クリックして「ファイル」をクリックし、「名前を付けて保存」後、画像ファイルタイプの「.TIF」を選択する]をクリックします。 注：ステップ5.4で説明したように撮影したときにこれは通常、単一の2分のタイムラプス取得から61の.tifイメージファイルを生成します。 6. MT動力学解析 EB3追跡のために、plusTipTrackerソフトウェア35を使用し 、オープンソース、自動検出、追跡、分析、および蛍光標識したEBの可視化のために設計されたMatLabのベースの計算ソフトウェアパッケージ。 plusTipGetTracksグラフィカルユーザインタフェース（GUI） plusTipGetTracks GUI、型plusTipGetTracksにアクセスします。 EB3彗星検出のために、.tifファイル画像を含む親ディレクトリを参照して選択するには、GUIを使用しています。 plusTipGetTracks GUIのトラッキングパラメータパネル内で、次の値を入力します。検索範囲半径= 5から10に。最小サブトラック長= 3;最大ギャップ長（フレーム）= 12;最大収縮係数= 1.0;最大角度フォワード= 25;最大角度下位= 10。変動半径（ピクセル）= 2;フレームレート（秒）= 2;ピクセルサイズ（ミクロン）= 110。 注意：まずtifファイル、画像ファイルの代表的なセットにplusTipParamSweepGUIを使用して、最適なトラッキングパラメータを確認してください。画素サイズに入力した値は、タイムラプス画像を取得するために使用される対物レンズに固有のものですS（上記、ステップ5.1から5.2を参照してください）​​。 関心領域（ROI）の選択のために、手動でポリゴンを形成する細胞のDIC画像を用いて、セル端を追跡することによって、全細胞のバイナリマスクを作成します。 関心のサブ領域（サブROI）選択のために、手動で変更plusTipTrackerサブROI選択ツールを使用して、関心の創傷縁セルを横切って2ポイント太い線を引くことで、先頭と末尾のエッジマスクを作成します。 注：行は、目的のセルが隣接創傷エッジ・セル31を越えて延びている位置での創傷端に平行に描かれるべきです。 plusTipSeeTracksのGUI 確認して、視覚的にトラックオーバーレイの欄のボタンを "プロットは、トラック」をクリックするだけで「ROI」フォルダに保存されているの.tifイメージのトラックオーバーレイを検査します。すべてのトラックのオーバーレイのために繰り返します。 オプション設定欄に「作成グループ」ボタンをクリックすることで、データのグループ化を実行します。 experimを選択データファイルをクリックすることで、同じデータセットに属している内部のデータ。 「グループ」簡単に（例えば、「対照群」）に識別できる名前を与​​えることによって、選択を保存します。 サブROI MT成長ダイナミクス測定のために、画像の最小数は1 EB3彗星のトラックが「トラック」としての資格と、先頭と末尾のエッジのROI内のMT成長遠足を抽出するためにサブROI内で検出されなければならないことをフレーム入力してくださいGUIの「サブのROI」パネル内の「手動選択」をクリックして。 注：たとえば、として抽出する最小検出長として3フレーム（6秒）を使用し、「トラック」。サブのROIから抽出されたトラックは、各セルの元のROIフォルダ内のサブプロジェクトフォルダ内に保存されます。 MTの成長サブトラックと部分集団解析平均MTの成長速度を計算し、「グループ」のデータセット（ステップ6.3.2を参照）MT成長寿命を意味し、各ROIのための（STEを参照してくださいP 6.2.4）、および各サブROI（ステップ6.2.5を参​​照）。 plusTipSeeTracks GUIのクアドラント散布図の列の中で、「グループの選択」をクリックして比較する（ステップ6.3.2で作成した）グループをクリックしてください。 x軸オプションの「成長スピード」を選択し、ボックスに（ステップ6.3.4から）成長速度の平均値を入力します。 y軸オプションの「成長寿命」を選択し、ボックスに（ステップ6.3.4から）成長寿命の平均値を入力します。 「開始/終了時にトラックを削除」し、次へ]の横のボックスをチェック「グループでのバッチプロセスを。」 MT成長セル全体のためのトラック、前縁の配布プロファイルを生成するために、「プロットを作成する」をクリックし、立ち下がりエッジサブのROI。 注：ここで説明する研究のために、MTの成長トラックは4亜集団に配布されますが遅いと短命、遅いと長寿命、高速かつ短命、迅速かつ長寿命。 <li>は表計算ソフトウェアプログラムにステップ6.3.4からの平均値をコピーし、拡張子.XLSでファイルを保存します。 クリックして「データ」[データのドロップダウンウィンドウから「データ分析」をクリックしてください。 「t検定を：等分散を仮定して、2つのサンプルは、「選択MTの成長速度とMT成長寿命を意味比較すること。 t検定比較はp値<0.001になり、スプレッドシート内のデータセルを強調表示します。 7.共局在解析イメージングソフトウェアプログラムの「ラインツール」を使用してバックグラウンド減算については、グリーンチャンネル画像（488 nm励起）に10μmの2である正方形の形状を作成するために、画面上でクリックすることにより、関心領域（ROI）を描くに何の細胞蛍光（バックグラウンド）が存在しない位置。ステップ5.8からの画像を使用して、赤チャンネルの画像（561 nm励起）のためにこれを繰り返します。 イメージングソフトウェアの広報を使用して、ogram、右のステップ7.1からROIをクリックして選択し、「背景ROIとして設定します。」をクリックして「画像」全体から（ステップ7.1から）の平均バックグラウンド値を減算するドロップダウンウィンドウから「減算背景」をクリックしてください画像。エム・オーロラAのいずれかmCherryを-MCAK、マップル-EB3、またはマップルチューブリンを共発現する細胞のためのバックグラウンド減算を実行します。 バックグラウンド減算赤チャンネルの画像でのみ、バイナリリボンをクリックして、「しきい値の定義」を選択し、指定された蛍​​光マーカーを排除する「チャネルあたり」機能を選択します。 注意：しきい値のステップは、具体的に共局在解析（ステップ7.4を参照）のための閾値化オブジェクトをマークされた行を描画できるようにmCherryを-MCAK、マップル-EB3、またはマップルチューブリンイメージのいずれかで実施しました。 イメージングソフトウェアでラインツールを使用して、閾値処理画像内の除外オブジェクトの上に2点太い線を引きます。 ステップ7.4で引かれた線オブジェクトを選択します。コピーして、それに対応する緑のチャンネル（エム・オーロラA）画像上に赤チャンネルからのラインオブジェクトを貼り付けます。 ラインが​​イメージングソフトウェアプログラム内のドロップダウンウィンドウから「メジャー」、次に「強度プロファイル」を選択することによって、個々のセルのための共局在および総エム・オーロラAの値を計算するために、オブジェクトの下にグレースケール画素強度値を測定します。 表計算ソフトにエクスポートし、型.XLSとしてファイルを保存することによって実験的治療とサブセルラー地域（例えば、「control_grayscale_intensity.xls」）によってデータを整理します。 注：この方法で示されたデータは、サブセルラー地域あたりの総実測エム・オーロラAの共局在の割合を表します。 ステップ7.6、繰り返しステップ6.3.7からの測定値を使用して有意性のカットオフように、p <0.05を用いて統計的有意性を計算します。 <pクラス= "jove_title"> 8。免疫蛍光パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒドの同時抽出/固定バッファ（PGF-PHEMで細胞（ステップ3.4参照）を修正しました; 4％パラホルムアルデヒド、0.15％グルタルアルデヒド、60mMのパイプ、27.3 mMのHEPES、10mMのEGTA、および8.2 mMの硫酸マグネシウムで0.2％の洗剤4、RTで10分間、pH7.0）で。 1×PBSの2ミリリットルで5分間、3回すすいでください。 反応性アルデヒドをクエンチするために0.01グラム/ミリリットルのNaBH 4での1×PBSで15分間、2回を扱います。 注意：カバースリップを浮遊させることができるのNaBH 4フォームの泡を。カバースリップはこれらのインキュベーション中に沈めたままにすることが重要です。カバースリップがフロートし始めた場合、気泡が脱出することを可能にするためにカバースリップの一端を高めるために鉗子を使用しています。 RTで1時間ロッキングプラットフォーム上で1×PBS中の5％無脂肪乳でブロッキングする前に、1×PBSで2回洗浄します。 およびラット抗αチューブリン（：一次抗体（千）ウサギ抗pT288-オーロラA（1）で細胞をインキュベート500）1×PBS溶液中で調製：1。ロッキングプラットフォームの一晩に4℃でインキュベートします。 2時間5％の無脂肪牛乳で製造した二次抗体と共にインキュベートする前に、1×PBS中で5分間、3回の一次抗体を除去し、すすぎ（千）ロバ抗ウサギ（1​​：1,000）およびヤギ抗ラット（1） 37℃。 蛍光最適化された封入剤でスライドガラス上にマウントカバースリップ。明確なマニキュアを使用してスライドにカバースリップの端をシールし、そして4℃で暗所で保存してください。 9.細胞遊走アッセイ上記のように移動アッセイのために、HUVECの培養を行う（プロトコル3：カバースリップ上でcDNAをトランスフェクションおよびHUVEC文化、3.2から3.3のステップ）。 細胞トランスフェクション、80μlの完全な内皮基礎培地と救助トランスフェクトした細胞を次に示します。乾燥したフィブロネクチンでコーティングした22-mmの丸号1.5カバースリップの中央に一滴として80μlのサンプルをピペット。 80μlのDROを広げないでください。P。コンフルエント単層に細胞接着のための時間を可能にするために3-4時間、37℃でインキュベートします。 注意：カバースリップを乾燥はカバーガラスの接触の際に広がるから80μlの低下を防止する必要があります。このアプローチは、HUVECををカバースリップの小さな領域に集中することを可能にし、それによって細胞のコンフルエントな単層の急速な形成を促進します。 非付着細胞を除去するために、完全な内皮基礎培地で2回洗浄します。 「傷の端、「静かに（ステップ9.2から）HUVEC単層全体にきれいなカミソリの刃をドラッグすることにより滅菌カミソリの刃でカバースリップをこすりを作成します。掻き中にカミソリの刃の滑りを防止するために鉗子で所定の位置にそっとカバーグラスを保持します。 細胞は3時間37℃のインキュベーターで回復することを可能にします。アセンブルおよびイメージングのためのカバースリップ（S）をマウント（プロトコル4を参照）。 使用して、顕微鏡で12時間、10分間隔で位相コントラストおよび488nmの画像を取得10×0.45 NA相対物レンズと、画像取得ソフトウェアプログラムの「ND取得」パネルを使用して0.52 NA LWDコンデンサー（ステップ5.3参照）。 HUVEC分岐および移行の10定量分岐解析のために、さらには細胞照明と公正な定量化を可能にするために、トランスフェクトされたHUVECの顕微鏡画像を取得する（ステップ3.3を参照）、マップル-C1 cDNAは、細胞容積マーカーを発現構築。 イメージングソフトウェア・プログラムを使用して、マップル-C1の画像を開いて、膜が湾曲の最大角度を表示枝の両側に位置するラベル。直線で、これらの2つの点を接続します。この行は、「分岐元」です。 イメージングソフトウェアのラインツールを使用して、視覚的にステップ10.2で決定された「分岐元」から長さが>10μmで測定枝を識別します。目からの距離を測定することによって、分岐の長さを計算します枝の先端の最遠位点に電子「分岐元」（ 図4参照）。 取得するために、長さ> 10μmの測定分岐鎖状の突起数カウント「セル枝番を。」 実験が含まれる場合、移行の分析のために、ステップ9.6において収集された画像を使用して、視覚的に物理的な場所に基づいて（創傷の縁に物理的に、すなわち細胞）と発現プロファイルを創傷エッジHUVECを識別する（ すなわち 、緑色創傷縁セルを選択GFPの発現）。 細胞の位相コントラスト画像を用いて、視覚的に核（セルの中心に近い半透明の球状構造）を識別し、次に視覚的に核小体（核内小、暗色、球状構造）を識別タイムラプス画像の最初の時点。核小体のx、y座標を標識するために核小体の位置をクリックします。 イメージングソフトウェアを使用して、手で追跡タイムラプスムービー（ 図4）の各フレームに核小体のx、y座標を標識する核小体の位置をクリックして、連続するタイムラプス画像で核小体。 イメージングソフトウェアを使用すると、「ファイル」をクリックして、その後の.xls」後、画像ファイルの種類を選択する]をクリックし、「名前を付けて保存をクリックしてください。」 表計算ソフトを使用して（ステップ10.8から）手追跡データファイルを開きます。平均移動速度を計算し、原点に移動距離を意味します。 表計算ソフトウェアプログラムを使用して、[データのドロップダウンウィンドウから「データ分析」をクリックして「データ」をクリックしてください。統計的有意性のカットオフとして> 95％の信頼度で分散検定のボンフェローニ補正され、一方向の分析を選択します。