Menselijke placenta en deciduale Organ culturen om infecties bij de moeder op foetus Interface Studie

De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de principes die in de Verklaring van Helsinki. Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of California, San Francisco (CHR # 11-05530). Alle patiënten gaven schriftelijk toestemming voor het verzamelen van monsters en de daaropvolgende analyse. Weefsel werd verzameld als de-aangewezen exemplaren. NB: De onderzoeker moet de goedkeuring van hun institutionele menselijke proefpersonen review board te verkrijgen. De uitsluiting van monsters op basis van zwangerschapsduur verhaal of placenta afwijkingen zijn afhankelijk van de behoeften van elke specifieke studie. LET OP: Geschikte veiligheid (bioveiligheid niveau 2) moeten worden gebruikt voor alle stappen in dit protocol 12. 1. Voorbereiding, Voorafgaand aan Collection Day Autoclaaf zeven / tang voor het verzamelen, en schaar / pincet voor micro-dissectie. Bereid voldoende volume (500 ml per monster) van Wash buffer (refer naar tabel 1 voor recept). Bereid voldoende volume (100 ml per monster) van 0,22 pm steriel gefiltreerd Collection media (zie tabel 1 voor recept). Aliquot extracellulaire matrix (ECM, zie tabel van de reagentia voor meer informatie) voor de lange termijn opslag. WINKEL ECM in vaste vorm bij -20 ° C. Voor de beste prestaties te vermijden herhalen Vorstproef. Dooi fles een viskeuze oplossing bij 4 ° C, en 300 ul aliquots bereiden in de koude kamer met gekoelde pipetpunten. WINKEL aliquots bij -20 ° C. 2. Verzameling van Fresh Tissue LET OP: Bij het werken met verse menselijk weefsel, moeten onderzoekers Universal Voorzorgsmaatregelen (OSHA) voor het voorkomen van de overdracht van Bloodborne Pathogens volgen en moet de juiste institutionele opleiding hebben gekregen. Persoonlijk beschermende uitrusting, met inbegrip van handschoenen, oogbescherming, en lab jassen zijn noodzakelijk. Vervoergeautoclaveerd-zeven (een per monster), geautoclaveerd-tang, Wash buffer (mandfles), Collection media (25 ml per monster in een 50 ml conische buis), spray fles, 10% bleekmiddel, 70% ethanol, weefsel opvangbak, sharpie en ijsemmer / koeler naar het ziekenhuis / kliniek. OPMERKING: Modellen worden ontvangen in een onderzoek aangewezen ruimte gelegen in een kamer dicht bij de operatiekamer suite. Een steriele weefselkweek kap is niet verplicht, maar collectie moet snel gebeuren en de onderzoeker moet op de juiste wijze te ontsmetten oppervlakken, zoals hieronder beschreven. Plaats mandfles wasbuffer naast de wastafel, en spuit spigot met 10% bleekmiddel en 70% ethanol. Plaats glasvlies opvangbak van de lichtbron (licht pad of lichtbak), en ontsmetten met 10% bleekmiddel en 70% ethanol. Laat aan de lucht drogen. Hebben de clinicus carry exemplaren uit de operatiekamer suite met het model voorbereiding kamer. Bij de gootsteen, giet het monster bovenop steriele hand-held zeef, spoel weefsel meerdere malen in wash buffer, en de overdracht van hele model in buffer om ontsmet glasdienblad bovenop lichtbron. OPMERKING: Evaluatie van weefsel door de arts is de hoogste prioriteit, dus de volgende stappen worden alleen uitgevoerd nadat de arts mondeling heeft aangegeven dat hij / zij heeft de evaluatie afgerond. Gebruik steriele tang om placenta villi en decidua (Figuren 2A en 3A) voor de inzameling te selecteren en over te dragen aan 50 ml conische buizen te scheiden. Label de buizen met zwangerschapsduur. LET OP: De voorkeur zwangerschapsduur leeftijden zijn minder dan 9 weken en minder dan 16 weken voor de placenta en decidua, respectievelijk. Voor deze instelling wordt slechts een fractie van elk monster verkregen voor onderzoeksdoeleinden, zoals voldoende weefsel voor klinisch pathologische diagnose moet blijven. Bewaren en transporteren specimen op het ijs aan het onderzoek lab. Om meer dan één exemplaar te verzamelen, ontsmetten de glazen schaal zoals hierboven beschreven met 10% bleekmiddel en 70% ethanol tussen de collectie van elk monster. 3. Voorbereiding van de orgelcultuur Plates OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van een steriele techniek in een weefselkweek kap. Het is ideaal voor de dissectiemicroscoop worden in een steriele omgeving. Dit is echter niet absoluut noodzakelijk zolang micro-dissectie spoed uitgevoerd en instrumenten worden vaak ondergedompeld in 70% ethanol. Dooi ECM flacon (s) op ijs. Verdun het ECM 1: 1 met ijskoude Collection media, meng door pipetteren. Pipet langzaam te voorkomen dat er bubbels. Elk putje van een 6-well weefselkweek plaat moet 100 ul van deze schorsing en zal plaats bieden 3-4 orgel culturen. Plaats Transwell inzetstukken (poriegrootte 0,4 uM) in elk putje van 6-well weefselkweekplaat. Coat elk Transwell inzet met een dunne laag (100 ui) van de ECM / Media suspensie. Plaats de plaat op ijs en onmiddellijk naar establishment van orgaankweken. Als alternatief, de voorbereiding van de plaat voorafgaand aan weefsel collectie, in welk geval wikkel het in para-film en bewaar bij 4 ° C voor later gebruik. Opslag langer dan 6 uur wordt niet aanbevolen als de ECM zal uitdrogen. 4. Vaststelling van Orgaan Cultures OPMERKING: Deze stap wordt beschreven hoe u deciduale orgel culturen en villous orgel culturen plaatsen in aparte transwells. De weefsels niet in contact. Onderzoekers geïnteresseerd in een co-kweek techniek waarbij decidua en villi in direct contact met elkaar, kunnen verwijzen naar voorafgaande literatuur 9,10. Spoel exemplaren tweemaal in Collection media, en centrifugeer bij 1000 xg tussen elke spoeling. Transfer weefsel in een steriele petrischaal en plaats op het podium van een dissectie microscoop. Houd 6-well plaat op ijs naast de microscoop. Micro-ontleden weefsel met steriele springer ontleden schaar en pincet, tot 2-3 mm villous orgelcultuur te vestigens (Figuur 2A). LET OP: Villous orgel culturen zijn kleine, goed doorbloed "bomen" met 2 of 3 takken, en met prominente extravilleuze trofoblast (EVT) cel kolommen 11. Het is belangrijk om alleen villus weefsel van <9 weken eerste trimester exemplaren gebruiken als invasie van extravilleuze trofoblasten in ECM is het meest uitgesproken op deze jonge leeftijd 13. Selecteer goed doorbloed villi met prominente EVT cel kolommen. EVT cel kolommen worden gevisualiseerd als bolvormige "fuzzy", "pluizig" uiteinden (zie pijlen in figuur 2A). Gebruik steriele tang om 3 of 4 villous bomen dragen in elk Transwell. Stel takken dus boom vlak boven ECM en aparte samengeklonterd takken wordt geplaatst. Micro-ontleden deciduale weefsel met steriele springer ontleden schaar en pincet, tot 3 mm 3 deciduale orgel culturen (figuur 3A) vast te stellen. LET OP: Monsters bevatten twee distinct typen decidua weefsels decidua parietalis en decidua capsularis (links en rechts weefselfragmenten respectievelijk Figuur 3A). Trim met een schaar tot 3 mm 3 stuks decidua parietalis te creëren. Decidua capsularis wordt niet gebruikt voor deze culturen. Gebruik een tang om weg te plagen elke geronnen bloed van de moeder. Gebruik een steriel pincet tot 3-4 stukken decidua te zetten in elk Transwell. 1 ml Collection media toe te voegen aan bodem van de put. Incubeer plaat overnacht bij 37 ° C in 5% CO 2 Voor experimenten waarbij het ​​belangrijk om de normale eerste trimester placenta zuurstofspanning nabootsen, handhaven villous orgaankweken in relatieve hypoxie (3% O 2). LET OP: Laboratorium opties omvatten kleine hypoxia incubator kamers die passen binnen de bestaande incubators, of een tri-gas incubator dat de externe N 2 gas introduceert om de zuurstofconcentratie te verlagen. Voeg 1 ml Villous of decidua medium (Table 1) naar boven van transwell na 12-16 uur van de cultuur. LET OP: De afwezigheid van de media tijdens de eerste overnachting in de cultuur maakt het extravilleuze trofoblast cel kolommen binnen te vallen (villous cultuur), en voor het weefsel (zowel villous en deciduale) veilig ingebed in ECM geworden. In onze ervaring, deciduale orgel culturen blijven nog gedurende 72 uur en villous orgel culturen voor 96 uur. We raden experimentele eindpunten dat binnen deze periode valt. Zie tabel 1 voor samenstelling van villi en decidua medium. Villous medium een hoog percentage FBS, terwijl decidua medium aangevuld met zwangerschap hormonen (progesteron, 17β-oestradiol) de gedecidualiseerde toestand (tabel 1) te handhaven. 5. Bereiding van L. monocytogenes Cultures NB: Voor gedetailleerde protocol over de lange termijn opslag van L. monocytogenes, en de cultuur en de groei van this organisme in de hersenen het hart infusie (BHI) bouillon en agar, verwijzen wij u naar Wang et al. 14 Kies een enkele L. monocytogenes kolonie van uitgestreken BHI agar plaat en het enten van 3 ml BHI bouillon. Incubeer de L. monocytogenes cultuur overnacht (16 uur), in een schuine stand, bij 30 ° C. LET OP:. Deze kweekomstandigheden toelaten de groei van bacteriën aan stationaire fase te bereiken L. monocytogenes wordt flagellated bij 30 ° C, welke gastheercel invasie 15 toeneemt. 6. Infectie van Organ culturen met L. monocytogenes Warme PBS en villi of decidua medium (tabel 1) tot 37 ° C. Gebruik steriele pincet één orgaankweek stukken die niet binnendringen in de ECM, en daarom drijven in de put te verwijderen. Zorgvuldig aspireren media van de onderkant van Transwell. Spoel de bovenste en onderste transwells tweemaal door voorzichtig pipetteren 1 ml van de oorlogben PBS in goed en zorgvuldig opzuigen in tussen. Voorzichtig pipet 1 ml van antibiotica-vrij Villous of deciduale media om de bovenste en onderste transwell. Wees voorzichtig met de orgelcultuur niet te verstoren. Laat het weefsel incuberen in een antibiotisch-vrij medium gedurende ten minste een uur zodat antibiotica zijn verwijderd. OPMERKING: Bij stationaire fase de dichtheid van de L. monocytogenes cultuur is ongeveer 1 x 10 9 kolonievormende eenheden (CFU) per ml. Het aantal bacteriën gebruikt om orgaankweken infecteren moet empirisch bepaalde experimentele behoeften voldoet. Voor wild type L. monocytogenes infectie routine experimenten tonen robuuste invasie met een 1:50 verdunning van de nacht (4 x 10 7 L. monocytogenes in 1 ml medium per putje). Resuspendeer het juiste aantal bacteriën in antibioticumvrij Villous of deciduale medium. Aspireren media van de bovenkant van transwells. Zachtjes voeg 1 ml van de entstof. Incubeer de platen bij 37° C in 5% CO 2 om voor bacteriële invasie. Verwijder extracellulaire bacteriën door opzuigen media van de bovenste en onderste transwells. Spoel putten tweemaal met warm PBS. Voeg 1 ml van de villi of decidua medium aangevuld met 50 ug ml Gentamicine -1. Incubeer de platen bij 37 ° C in 5% CO2. LET OP: L. monocytogenes is een facultatief intracellulaire bacterie die kan groeien in extracellulair medium te groeien binnen cellen en verspreiden van cel tot cel zonder naar de extracellulaire ruimte. Gentamicine een bactericide effect op extracellulaire L. monocytogenes, en staat aldus meten van intracellulair L. monocytogenes groei en verspreid via de orgelcultuur 16. LET OP: Reproduceerbare L. monocytogenes infectie van villi en decidua orgaankweken optreedt bij 5 uur incubatie tijden. De incubatietijd voor toevoeging van gentamicine kan worden gemodificeerd op basis van experimentele behoeften en abiliteit van het organisme om het weefsel binnen te dringen. Om een beter inzicht anatomische plaatsen meest vatbaar voor infecties kunnen kortere incubatietijden gebruikt 2. Handhaaf platen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende de duur van het experiment. Wijzig hele media in elk putje dagelijks. NB: In onze ervaring, L. monocytogenes geïnfecteerde deciduale orgel culturen levensvatbaar blijven voor 48 uur en villous orgel culturen voor 72 uur. 7. Harvest of Organ Cultures for Histopathologie Bereid een verse oplossing van 4% paraformaldehyde door verdunning 10 ml van een 16% stock ampul in 30 ml PBS. Store 4% paraformaldehyde bij 4 ° C, beschermd tegen licht en gebruik binnen een week. Breng aan kamertemperatuur voor gebruik. Aspireren media van de bovenste en onderste transwell. Voorzichtig spoelen putjes tweemaal met PBS bij kamertemperatuur. Voorzichtig toe te voegen 1 ml 4% paraformaldehyde naar boven transwell volledig te bedekken de orgelcultuur. Incuberenin 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Vermijd langere incubatietijden daar dit kan leiden tot over- fixatie van het weefsel. Aspireren paraformaldehyde en spoelen putjes tweemaal met PBS bij kamertemperatuur. Integreer de vaste orgel culturen in oktober medium, te bevriezen, en sectie over een cryostaat ( "vaste bevroren"). In het algemeen vaste bevroren weefsel makkelijker punt dan bevroren weefsel, zonder voorafgaande fixatie. NB: Voor de volledige protocol over oktober inbedding en bevroren snijden, dan kunt u toegang krijgen tot relevante hoofdstukken van gepubliceerde protocollen 17,18. Afhankelijk van de experimentele behoeften en de beschikbare laboratoriumapparatuur en opslag, kan het weefsel in plaats daarvan in paraffine ingebedde en coupes op een microtoom 19. Verder voor te bereiden weefsel dia's voor routine hematoxyline & eosine kleuring, immunofluorescentie, of immunohistochemie 18,20,21.