Meyve Fly Yetiştirme<em> Drosophila melanogaster</em> Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında
Summary
Aksenik ve gnotobiyotik koşullarda Drosophila melanogaster yetiştirme için bir yöntem sunulmuştur. Fly embriyolar, sodyum hipoklorit dechorionated steril diyet aseptik transfer ve kapalı kaplarda yetiştirilir. Bakteri ile diyet ve embriyolar aşılamak gnotobiyotik dernekler yol açar ve bakteriyel varlığı tüm vücut Drosophila homojenatları kaplama ile teyit edilir.
Abstract
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
Introduction
Çoğu hayvan yakından ölüme 1 doğumdan bakterilerin ( 'Mikrobiyota') ile ilişkilidir. Mikroorganizma içermeyen ( 'aksenik') ve mikroorganizma ilişkili (konvansiyonel) hayvanların karşılaştırılması mikropların metabolik, besinsel, vasküler, hepatik, solunum, immünolojik, endokrin ve nörolojik fonksiyon 2 olmak üzere hayvan sağlığı çeşitli yönlerini, etkilediği gösterilmiştir. Meyve Drosophila melanogaster mikrop 3,4 mevcudiyetinde Bu yöntemlerin pek çoğu anlaşılması için ve hayvan sağlığı 5,6 ilgili Mikrobiyota etkisini incelemek için önemli bir modeldir uç. Hiçbir bakteri türleri her birey ( 'çekirdek') mevcuttur, ancak Asetobakter ve Lactobacillus türlerinin sayısal hem laboratuvar yetiştirilen ve vahşi yakalanmış D. Mikrobiyota hakim melanogaster. Acetobacteraceae, Firmi (Komagataeibacter ve Gluconobacter dahil)ve Enterobacteriaceae (örneğin Enterococcus ve Leuconostoc gibi) cutes ya yüksek bolluk 7-12 düşük bolluk Drosophila bireylerde sıklıkla mevcut ya da düzensiz mevcuttur.
Drosophila ve memelilerin Mikrobiyota içinde ve nesiller 14,19 karşısında kararsız olduğunu. Mikrobiyota bağımlı özellikler ölçerken Mikrobiyota değişkenlik fenotipik gürültüye neden olabilir. Örneğin, Drosophila 15-18 Acetobacteraceae etkisi lipid (trigliserid) depolama. Acetobacteraceae başka 19'unda birden flakonun sinekler daha bol iseniz, izogenik sinekler farklı fenotipleri 20 olabilir. Farelerde 14 Mikrobiyota inconstancy sorununa yönelik bir çözüm, fare yavrular (Schaedler florası değiştirilmiş) her yeni nesil 8 baskın mikrobiyal türlerin tanımlanmış bir topluluk getirerek, 1960'lı yıllardan bu yana uygulamada olmuşturHer yavru fare Mikrobiyota aynı anahtar üyelerine maruz sağlamak. Mikrobiyota çalışmanın 32 birincil hedefi değildir ve deneysel koşullar, çeşitli önemli mikrop varlığını sağlamak için bir örnek teşkil bile Bu uygulama Mikrobiyota bileşimi için kontrol eder.
Drosophila beslenme mikropların etkisini tanımlamak için, aksenik sinek hatları türetmek için çeşitli protokoller embriyoların hipoklorit dechorionation (ya türetilmiş de novo her nesil veya steril diyetler transferi ile generationally tutulan) ve antibiyotik tedavisi 13 de dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Bu tür antibiyotikler tedavi ve seri transferi, de novo dechorionation ile karıştırıcı değişkenler (örneğin, yumurta yoğunluğu, artık kirletici mikrop, hedef dışı antibiyotik etkiler) karşı daha fazla kontrol her ikisi için de kolaylık ve hızlılık gibi farklı yaklaşımlar faydaları vardır. Ne olursa olsun yöntemininEmbriyoların aksenik belirtilen mikrobiyal türlerin hazırlama, tanıtım tanımlı ( 'gnotobiyotik') toplulukları ile Drosophila kültürü izin verir. Alternatif olarak, Schaedler florasının kullanımı taklit bu topluluk her flakon sürekli-etkileyen mikropların varlığını sağlamak ve Mikrobiyota inconstancy komplikasyonlarını önlemek için (sadece birkaç adım 6-7 takiben) geleneksel-koydu yumurta inoküle edilebilir. Burada embriyoların de novo dechorionation tarafından aksenik ve gnotobiyotik Drosophila yükseltmek için protokol tarif ve tanıttı veya kontamine mikrobiyal takson varlığını teyit için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan yöntem birlikte aksenik yetişkinlerin 18,27 seri devir veya antibiyotik tedavisi 13,18 dahil aksenik sinekler, yetiştirme alternatif yöntemlerle, embriyo dechorionation 8,11,18,25,26,27 birkaç yaklaşımlardan biridir. Diğer dechorionation yöntemleri etanol yıkamaları yer alır ve 11,25,26 azaltmak ya da 8 hipoklorit uzanır. (Etanol yıkar olmadan) burada belirtildiği gibi yetiştirilen zaman 100 Drosophila genotipleri aks…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokolün bazı detayları da yazının yararlı yorum sağlanan Dr. Adam Dobson, yardımı ile optimize edilmiştir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (FNIH) hibe sayısı R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD ve AED). FNIH hibe sayısı 1F32GM099374-01 (PDN) ve Brigham Young University başlangıç fonları (JMC, MLK, MV). Yayın maliyetleri Brigham Young University Yaşam Bilimleri Koleji ve Bitki ve Yaban Hayatı Bilimleri Bölümü tarafından desteklendi.
Materials
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher–Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastic Bushing | Home Depot | 100343125 | http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Laboratory Product Sales | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter Pipette Tips, 300μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html |
| 1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filter Pipette Tips, 1000μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/ |
| Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
Referenzen
- McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due–animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, 1968-1973 (2015).
- Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
- Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
- Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
- Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
- Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
- Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
- Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
- Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
- Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
- Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
- Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
- Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
- Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
- Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
- Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
- Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
- Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
- Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
- Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
- Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
- Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
- Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
- Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
- Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
- Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
- Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
- Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).
