La cría de la mosca de la fruta<em> Drosophila melanogaster</em> Bajo axénicos y Condiciones gnotobióticos
Summary
Se presenta un método para la cría de Drosophila melanogaster en condiciones axénicas y gnotobióticos. Volar embriones se dechorionated en hipoclorito de sodio, de manera aséptica a la dieta estéril, y se ha criado en contenedores cerrados. La inoculación de la dieta y los embriones con bacterias conduce a asociaciones gnotobióticos, y la presencia bacteriana se confirmó mediante siembra de todo el cuerpo homogeneizados de Drosophila.
Abstract
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
Introduction
La mayoría de los animales están íntimamente asociados con las bacterias ( 'microbiota') desde el nacimiento hasta la muerte 1. Las comparaciones de los animales libres de microorganismos ( 'axénicos') y de microorganismos-asociado ( "convencional") han demostrado microbios influyen en diversos aspectos de la salud de los animales, incluyendo metabólico, nutricional, vascular, hepático, respiratorio, inmunológico, endocrino y la función neurológica 2. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es un modelo clave para la comprensión de muchos de estos procesos en la presencia de microbios y 3,4 para el estudio de la influencia de la microbiota 5,6 salud de los animales. Ninguna de las especies bacterianas están presentes en cada individuo ( "núcleo"), pero Acetobacter y Lactobacillus especies numéricamente dominan la microbiota de ambos D. criados en laboratorio y capturados en la naturaleza melanogaster. Otros Acetobacteraceae (incluyendo Komagataeibacter y Gluconobacter), Firmicutis (tales como Enterococcus y Leuconostoc), y enterobacterias son o bien presentes con frecuencia en individuos de Drosophila en baja abundancia, o irregularmente presentes en gran abundancia 7-12.
La microbiota de Drosophila y mamíferos no es constante dentro ya través de las generaciones 14,19. inconstancia microbiota puede conducir al ruido en la medición de rasgos fenotípicos microbiota-dependiente. Por ejemplo, el almacenamiento Acetobacteraceae influencia de los lípidos (triglicéridos) en Drosophila 15-18. Si Acetobacteraceae son más abundantes en las moscas de un vial que en otro 19, moscas isogénicas pueden tener diferentes fenotipos 20. Una solución para el problema de la inconstancia de la microbiota en ratones 14 ha sido en la práctica desde la década de 1960, mediante la introducción de una comunidad definida de 8 especies microbianas dominantes de crías de ratón cada nueva generación (SCHAEDLER alterado la flora),asegurando que cada cachorro está expuesto a los mismos miembros clave de la microbiota del ratón. Esta práctica controla para la composición de la microbiota incluso cuando la microbiota no es el objetivo principal de estudio 32, y establece precedente para garantizar la presencia de microbios clave en una variedad de condiciones experimentales.
Para definir la influencia de microbios en la nutrición Drosophila, varios protocolos para derivar líneas de vuelo axénicos se han desarrollado, incluyendo dechorionation hipoclorito de embriones (ya sea derivados de novo cada generación o mantenido generacionalmente por transferencia a las dietas estériles) y el tratamiento con antibióticos 13. Hay beneficios para diferentes enfoques, tales como la facilidad y rapidez, tanto para el tratamiento de antibióticos y la transferencia en serie, en comparación con un mayor control de las variables de confusión de novo dechorionation (por ejemplo, densidad de huevos, microbios contaminantes residuales, fuera de objetivo efectos antibióticos). Independientemente del método depreparación, introducción de especies microbianas especificados para los embriones permite axénicos cultura de Drosophila con las comunidades ( 'gnotobióticos') definidas. Alternativamente, imitando el uso de la flora SCHAEDLER, esta comunidad podría ser inoculado a los huevos puestos convencionalmente siguientes pasos (6-7 solamente) para garantizar la presencia de microbios de rasgos que influyen en cada vial y evitar las complicaciones de la inconstancia microbiota. A continuación se describe el protocolo para la cría de Drosophila axénicos y gnotobiótico de novo dechorionation de embriones, y para confirmar la presencia de taxones microbianos introducido o contaminantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí es uno de los varios enfoques para dechorionation embrión 8,11,18,25,26,27, junto con otros métodos de crianza de moscas axénicos, incluyendo la transferencia en serie de los adultos axénicos 18,27 o 13,18 tratamiento con antibióticos. Otros métodos incluyen dechorionation lavados de etanol y reducir 11,25,26 o se extienden 8 tratamiento con hipoclorito. Las diferentes etapas de lavado pueden ayudar a la cría de diferentes geno…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Algunos detalles de este protocolo se han optimizado con la ayuda del Dr. Adam Dobson, quien también proporcionó útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación para los Institutos Nacionales de Salud (FNIH) el número de concesión R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, y AED). FNIH número de concesión 1F32GM099374-01 (PDN), y Brigham Young University capital inicial (JMC, MLK, MV). gastos de publicación fueron apoyados por el Colegio Brigham Young University of Life Sciences y el Departamento de Ciencias de la flora y la fauna.
Materials
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher–Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastic Bushing | Home Depot | 100343125 | http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Laboratory Product Sales | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter Pipette Tips, 300μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html |
| 1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filter Pipette Tips, 1000μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/ |
| Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
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