만성 아밀로이드 - 베타 올리고머 주입의 동물 모델에서 신경 퇴행은 삼투 펌프와 항체 치료 인 퓨즈에 의해 상쇄되어

윤리 문 :이 프로젝트의 동물 프로토콜은 동물 관리에 캐나다위원회의 가이드 라인 준수에 HOPITAL 뒤 크레 쾨르 드 몬트리올의 동물 관리위원회의 승인을 획득했습니다. 정위 수술 전에 1. 카테터 준비 삼투 펌프와 캐 뉼러를 연결하는 데 사용되는 PE50 카테터 (길이 6cm) 컷 (도 1a 참조). 인공 뇌척수액 (ACSF)와 PE50 카테터를 입력하고 카테터의 양쪽 끝을 밀봉. 사용까지 4 ° C에서 카테터를 유지합니다. 정위 2. 정맥 주입 무균 조건에서 수술을 수행합니다. 고압 증기 멸균하여 모든 수술기구 및 재료를 소독. 정위 장치 철저히 작업 공간을 청소하고, 70 % 에탄올 용액으로 소독. 수술 용 마스크, 헤어 모자와 멸균 장갑을 착용 할 것. 복강 내 (IP) 및 케타민의 용액 자일 라진 (100 ㎎ / ㎏ 및 10 ㎎ / ㎏, 각각)을 주사하여 쥐를 마취. 부드러운 발가락 핀치 후 이동을 확인하여 마취를 확인합니다. 적어도 30 분 수술 전에 피하 (SC) 마취 된 동물을, 비 – 스테로이드 계 소염 약물 (1 ㎎ / ㎏ 멜 록시 캄)를 주입한다. 가위를 사용하여 동물의 머리를 면도하고, 클로르헥시딘 글루코 네이트 용액의 2 % 이소 프로필 알코올 2 % 3 회 피부를 소독. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 안과 연고를 적용합니다. 귀 막대와 정위 프레임에 동물을 배치합니다. 정위 프레임의 홀더 팔에 하나의 정맥을 수정합니다. 주사 (SC) 정수리 로컬 마취제 (부피 바카 인 (1.5 ㎎ / ㎏) 및 리도카인 (1.5 밀리그램 / kg). 마취가 3 % 이소 플루 란을 전달 노즈콘을 배치하여 전체 공정 동안 유지한다. 전체를 수술 부위는해야한다오프 드레이프 있지만 더 기술을 보여주기 위해 여기에 수행되지 않았다. 메스와 머리의 상단에 3cm의 절개를합니다. 분명 두개골을 떠나 절개 주위에 4 클램프를 설치합니다. 라운드 팁 가위를 사용하여, 동물의 어깨 뼈 사이의 피부 아래에 포켓 (2 × 2cm 2)를 확인합니다. 블레이드와 두개골의 골막을 다 쳤어요. 출혈이있는 경우 두개골에 거즈 패드를 적용합니다. 두개골은 평평하고 잘 정위 프레임에 정렬 있는지 확인합니다. 두개골이 평평한 지 확인하려면 높이가 브레 그마에서와 람다 좌표 확인합니다. 기준점으로 사용되는 브레 그마의 좌표를 가라. 해마에서 양측 이식 될이 가이드 정맥의 좌표 계산, 브레 그마에서 시작 (전후 : – 0.42 cm, mediolateral : 0.30 cm ±을, dorsoventral : – 0.28 cm를 팍시 노스 왓슨 쥐의 뇌 아틀라스에 따라) (29) . 나타냅니다마커로 정맥의 위치. 두 캐 뉼러의 주입 시점에서의 두개골에 구멍 (0.5 mm)을 뚫는다. 약 5mm 이상 그 점 아래 드릴 다른 두 개의 구멍이 치과 시멘트를 적용 할 때 정맥을 공고히 할 나사를 삽입합니다. 이전에 메스와 ACSF 가득 카테터의 한쪽 끝을 잘라하고, 정맥의 각도 팔에 삽입합니다. 치과 용 시멘트와 첫 캐 뉼러를 수정합니다. 두 번째 정맥에 위치 주위에 치과 용 시멘트를 넣어하지 마십시오. 2 치과 시멘트 건조 보자 – 3 분 후, 첫 번째 정맥에서 홀더 암을 제거하고 그 안에 두 번째 캐 뉼러를 해결. 반복 2.11 및 2.12 단계를 반복합니다. 모두 가이드 정맥에 더미 정맥을 넣습니다. 더미와 가이드 정맥이 조직 침투 및 정맥 차단을 방지하기 위해 동일한 길이 있는지 확인합니다. 이전에 동물의 어깨 뼈 사이에 주머니에 두 카테터의 끝을 삽입합니다. 클램프를 제거하고로 피부 스티치봉합 실 4-0. 참고 : 상단 가이드 정맥은 곧 Aβo의 주입 용 액세스 할 수 있어야합니다. 정위 프레임에서 동물을 제거하고 그 새장에 다시 넣어. 동물이 깨어 때까지 수술 후 회복 중, 가열 물 담요에 새장을 배치합니다. 필요한 경우 쥐가 열에 가까이 이동할 수 있도록 케이지 패드에 부분적으로해야한다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 지속적으로 동물을 모니터링합니다. 가까운 감시 아래 10 일 동안 수술에서 회복하기 위해 동물 시설에 쥐를 돌려줍니다. 참고 : 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 마십시오. 멜 록시 캄 (1 ㎎ / ㎏)의 통증을 치료하기 위해 수술을 다음 두 일 동안 하루에 한번 주어진다. 3. 삼투 펌프 설치 및 제어의 IgG1, 어느 날 설치하기 전에, 6E10 항체 (100 ㎕를 1 ㎎ / ㎖)로 삼투 펌프를 채우기항체 (1 ㎎ / ㎖, 100 μL) 멸균 조건 제조업체의 지시에 따라. 펌프를 활성화하기 위해 밤새 37 ° C에서 멸균 증류수에 펌프를 유지합니다. 삼투 펌프 (7 일 0.5 μL / 시간)를 설치하는 이소 플루 란 3 %와 쥐를 마취. 어깨 뼈 사이에 면도하고 클로르헥시딘 글루코 네이트 용액 2 % 이소 프로필 알코올 2 %로 피부를 소독. 가이드 정맥에 연결된 PE50 카테터를 찾을 어깨 뼈 사이의 메스와 2cm의 절개를합니다. 메스와 치과 용 시멘트를 포함하는 PE50 카테터의 끝을 잘라. PE50 카테터에 삼투 펌프를 연결하고 연결을 확보하기 위해 펌프와 카테터 교차점에 일부 치과 용 시멘트를 추가합니다. 봉합 실 4-0로 단단히 피부 만들기. 가열 물 패드의 장에 동물 다시 넣습니다. 이소 플루 란 마취 (약 5 분)에서 신속하게 동물의 여파를 관찰한다. 참고 : 수술 아프로 소요ximately 5 분 ~ 10. 4. Aβo 깨어에서 혼합 및 자유롭게 이동 쥐 이전에보고 된 바와 같이 Aβo 용액 (0.2 μg의 / μL)를 준비합니다. (28, 30)는 Aβo는 주입 전에 실온에서 1 시간 동안 동적으로 자발적으로 집계하도록 허용합니다. 주입 펌프에 2 개의 10 μL 주사기를 설치합니다. 멸균 증류수 5 μL와 주사기를 입력합니다. 메스로 길이 약 60cm 두 PE50 카테터를 잘라. 1 ml의 주사기와 21G 바늘을 사용하여 멸균 증류수로 두 카테터를 입력합니다. 카테터의 한쪽 끝에서 1 ml를 주사기를 유지하고 해밀턴 주사기에 다른 쪽 끝을 연결합니다. 1 ml의 주사기를 제거하고 카테터 내에 기포가 없음을 확인합니다. PE50 카테터의 끝에서 내부 캐 뉼러를 삽입합니다. 해밀턴 주사기에 μL TO1까지 멸균 증류수를 사용하여, PE50 카테터에 연결된 내부 캐 뉼러를 입력합니다. P에 의해 기포를 확인2 μL까지 피스톤을 다시 ulling. 최대 피펫 팅에 의해 및 준수의 최소한의 팁을 사용하여 아래로 Aβo 솔루션을 섞는다. 혼합시 거품을 형성하지 마십시오. 3.5 μL까지 피스톤을 다시 잡아 당겨 Aβo 솔루션의 1.5 μL와 모두 내부 캐 뉼러를 입력합니다. 전에 두 카테터에 다 기포 후 마커로 라인을 확인합니다. 이것은 지속적인 주입의 체크 포인트 역할을합니다. 주입의 경우, 주입 펌프 근처 케이지를 가지고와 그 덮개를 제거합니다. 이 붙에서 쥐를 놓고 단단히 쥐의 머리를 고정하기 위해 목에 붙 다의 팔을 다 쳤어요. 두 개의 가이드 정맥에서 더미 정맥을 제거합니다. 이전 가이드 정맥에서 제조 된 내부 캐 뉼러를 삽입합니다. 그들이 완전히 삽입 및 가이드 정맥의베이스에 잘 고정되어 있는지 확인합니다. 이 붙에서 쥐를 놓고 경합 스트레스를 제한하기 위해 새장에 다시 넣어. 카테터를 벗어나서 마치 비틀 지 않도록 면밀히 모니터링그녀와 주입이 제대로 이루어집니다. 주입 펌프를 켭니다. 0.1 μL / 분 (10 분)의 속도로 Aβo 액 1 μl를 주입한다. 주입하는 동안, 2.5 μL 3.5 μL에서 주사기의 피스톤 이동하는 것을 확인하고 모두 PE50 카테터에 기포가 연속적으로 이동한다는. Aβo 솔루션을 효율적으로 확산 할 수 있도록 주입 후 또 다른 5 분 동안 자리에 내부 캐 뉼러를 남겨주세요. 주입 액의 역류를 방지하기 위해 내부 캐 뉼러 및 출장 가이드 정맥을 제거하기 위해 다시 껴안다에서 쥐를 가져옵니다. 단지 캐 뉼러의 각도 암 전에 중지 더미 캐 뉼러를 사용합니다. 그 새장에 동물을 돌려줍니다. 6 연속 일 동안 하루에 한 번 Aβo 주입을 반복합니다. 잘린에 의해 동물을 안락사.