Kronik Amiloid beta Oligomer İnfüzyon bir hayvan Modelinde Nörodejenerasyon Osmotik Pompalar ile Antikor Tedavisi infüzyon ile giderilir
Summary
To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.
Abstract
(Gerçekler ve olaylarla ilgili hafıza) hipokampus bağımlı açık bellek düşüş Alzheimer hastalığı (AH) erken klinik belirti biridir. İyi sinaps kaybı ve ardından gelen nörodejenerasyon AD bellek bozuklukları için en iyi göstergesi olduğu bilinmektedir. Son çalışmalar klinik semptomlar belirgin hale gelmeden önce yaklaşık 10 ila 15 yr insan beyninde birikmeye başlar çözünür amiloid beta oligomerler (Aβo) nörotoksik rolünü vurguladı. Birçok rapor çözünür Aβo AD modelleri ve insanlarda hafıza açıkları ile ilişkili olduğunu göstermektedir. nöronal ve beyin kesit kültürlerinde görülen Aβo kaynaklı nörodejeneratif hastalıklar, birçok hayvan modellerinde çoğaltmak daha zor olmuştur. Burada gösterilen tekrarlanan Aβo infüzyon modeli bu sorunu aşmak ve yeni hastalık modifiye tedaviler geliştirmek için iki önemli etki ele izin: Erken AD teşhis etmek için biyolojik belirteçler tanımlamak ve moleküler mekanizmalarını belirlemeklog mekanizmaları AD başlangıcında Aβo indüklenen hafıza kaybı destek. çözünebilir Aβo agrega nispeten hızlı olarak hastaların klinik durumu ile zayıf korelasyon çözünmeyen Aβ fibrilleri için, çözünebilir Aβo taze hazırlanmış ve hipokampus belirgin hücre ölümünü üretilmesi için, altı gün boyunca günde bir kez enjekte edilir. Biz özel Aβo eşzamanlı haşlama ve ozmotik pompalar kullanılarak hipokampus Aβo antikoru (6E10) sürekli infüzyon için tasarım kanül kullanılır. In vivo yönteminde yenilikçi Bu şimdi ön-demans hastalarında Aβo birikmesini ve nörotoksisite engelleyebilecek yeni bir AD tedavilerin etkinliği gösterildi klinik öncesi çalışmalarda kullanılabilir.
Introduction
Başlangıçta beyinde çözünmeyen Aβ türlerin bu birikimi AD patogenezinde merkezi oldu önerilmiştir. 1,2 Ancak, amiloid plaklar da yaşlı bazı bilişsel normal algılanır. 3-7 plak yeminli ve bilişsel bozukluklar arasındaki mevcut zayıf korelasyon üstesinden gelmek için AD, son raporlar, bu nörotoksisite çok dinamik öne sürüldü olduğu hastaların klinik durumu ile çok daha iyi. 8-14 Aβ oligomerization süreci yana ilişkili hastalığın başlangıcında toksik çözünür Aβo varlığını göstermiştir Bunun yerine oligomerin yalnızca belirli bir tipte çeşitli Aβo indüklenir. 14-16 birçok çalışma Aβo sinaps ve nöronal kaybın önce sinaps bozukluklarını başlatabilir göstermiştir için, 17-24 mevcut teoriler Aβ ilgili tedavi etkili olabileceğini ortaya koymaktadır klinik çalışmalarda şimdiye kadar test olarak değil ileriki aşamalarında daha erken AD.
AD patogenezinde biri damgasını özelliği bellek açıkları klinik düzeyde saptanabilir olunca, lokalize beyin bölgelerinin görülen hastalığın geç evrelerinde gözlenen masif ve yaygın hücre ölümü ve önemli sinaps ve nöronal kayıptır. Entorhinal korteks kıvrımlarının (AK) (DG) çıkıntı perforant yolu AD erken başlangıcında belirgin rahatsız edilir. 25,26 AD prodromal devlet esnasında hafif kognitif bozukluk (MCI) belirgin önemli hücre ölümünü olduğunda DG sinaptik kayıp gibi AT saptanır. 25,26
Kanıt büyük bir gövde erken AD çözünür Aβo toksik eylemi kesin olarak belirlemiş olmasına rağmen, 8-14 Aβo kaynaklı nörodejenerasyon nöronal kültür veya Organotipik beyin kesit kültürü gözlenen hayvan modellerinde çoğaltmak daha zor olmuştur. 27 transgenik AD çoğu A aşırı ifade modelleriβ amiloid plaklar, Tau hiperfosforizasyon'un, sinaptik eksikliği ve bellek kusuru var. 27 Bununla birlikte, bu modeller AD hastalarının hipokampus gözlenen modelleme hücre ölümü daha az başarılı olmuştur. Bu teknik sorunları aşmak için biz çözünür Aβo intraserebral infüzyon dayalı bir model geliştirdi. Biz çözünür Aβo hipokampal infüzyon kademeli nöron kaybı ve Tau hiperfosforizasyon'un, MS bellek düşüş ile ilişkili iki patolojik işaretlerinden neden tekrarladı önce bildirmiştir. 28 Burada, özel Aβo eşzamanlı infüzyon için tasarım kanül kullanılarak AD tedavileri test etmek için yeni bir yöntem gösteriyor ve ozmotik pompalar ile Aβo antikoru (6E10) sürekli infüzyon.
Ozmotik pompalar doğrudan Aβo enfüzyon yerinde in vivo Aβo kaynaklı nörodejenerasyona karşı bir antikor (ya da diğer bileşiklerin) etkinliğini test etmek için özel bir yol sağlar. Bu nedenle, bu repr pompalarkatı bir proof-of-concept AD potansiyel terapötik ajanların etki mekanizmaları ile ilgili kurmak için kullanışlı bir araç ESENT. son raporlar AD erken dönemlerinde çözünür Aβo kritik etkisini işaret beri, Aβo yöneliktir birçok tedavi aslında akademik ve farmasötik laboratuarlar tarafından test edilmektedir. Bu yeni bir hayvan modeli, erken AD gözlenen sinaptik ve nöronal kaybın taklit sağlar ve ozmotik pompalar Aβo infüzyon yerinde özel olarak, sürekli işleme maddeleri aşılamak için kullanılır. Önceden demans hastalarında denemeler başlatmak üzere araştırmacılar istendiğinde hastaları hafif-orta son birkaç yıldır test edilen AD tedavilerin tekrarlayan başarısızlıkları Aβo bolca birikir ve geriye dönüşümsüz beyin hasarı oluşturmak için başlamadan önce. Bu bağlamda, çökelmesini ve Aβo dolayısıyla nörotoksisiteyi önlemek yeni bileşikler test klinik öncesi hastalarda ilgi çekici olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
özel dikkat gereklidir, bu protokol kapsamında kritik adımlar vardır. kanül implante zaman, ikinci kanül delik engelleme önlemek için çok sıvı diş çimento koymaktan kaçınmak. Tahrişe ve olası bir enflamatuar tepkiyi önlemek için pompaya bağlı P50 kateterin serbest ucunda diş çimento yerleştirilmesi önemlidir. stereotaksik cerrahi gün, kanül engellenmesini önlemek için kılavuz kanül olarak aynı uzunlukta kukla kanül kullanın. Ancak, kurduktan sonra pompalar kanül açısı kolu hipokampus için pompa çözümün doğru infüzyon izin önce durdurmak kısa kukla kanül kullanın. yakından Aβo infüzyon Monitör ve kateter yapılan hava kabarcığı infüzyon sırasında sürekli hareket olduğundan emin olun. Her zaman enjekte kanül tamamen infüzyon sırasında kılavuz kanül takılı olduğundan emin olun.
Sorun karşılaşma Aβ infüzyon sırasında iseIç kanül bloke olmadığından emin olun. Böyle bir durumda, iç kanül yoluyla steril distile su yıkayın. kılavuz kanül engellenirse, kılavuz kanül içine iç kanül açın. Aksi takdirde yukarı ve aşağı iç kanül taşıyın. sokulmayla içinde çekişme özellikle ilk gününde, sıçanlar için stresli olabilir. hayvan stresi azaltmak için, biz işlemek ve stereotaksik ameliyat öncesi sokulmayla için sıçan alıştırmak için önerilir.
Birçok avantajı bu romanı atfedilen ve in vivo yaklaşımı esnek olabilir. Gerçekten de, Aβo doğası doğru infüzyonundan önce bir kontrol edilebilir enjekte edilir ve Aβ preparatlar değişik türü (beyin türevli Aβ çözeltiler vs örneğin sentetik için) bunların in vivo nörotoksisiteyi değerlendirmek için enjekte edilebilir. Bu model aynı zamanda, çeşitli ol Aβ türleri (örneğin, monomer, düşük-mekanizmalar ve yüksek molekül ağırlığı araştırmak için kullanılabilirigomers, Ap protofibrillerinin) in vivo olarak nörotoksik etkileri olabilir ve immünoterapi gibi tedaviler beyinde bunların zararlı etkilerini karşı nasıl. Infüzyon uyanık, serbestçe hareket eden hayvanlar gerçekleştirmek beri daha önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, anestezik ajanların ve sinyal yolları üzerinde Aβo solüsyonu arasında karıştırıcı etkileri vardır. Özgürce hayvan hareketli 32,33 İnfüzyonları olan da davranış testi ile uyumlu herhangi bir zaman önce ve infüzyon sonrası.
Aβo ve pompa montaj enfüzyonları yaşlanma sırasında Aβo etkisini ve tedaviler belirlemek için farklı yaşlardaki hayvanda yapılabilir. nörodejenerasyon infüzyon bölgesine yakın gerçekleştiğinden, sinaps ve nöronal kaybın farklıdır ve lokalize beyin bölgelerinde indüklenebilir. Teminat Aβo infüzyonu ve kontrol (araç veya karıştırmak Aβ) aynı hayvan içinde herhangi bir değişiklik için kontrol sağlar. Bunun aksine, Aβo veya kontrol Solutions sağ taraflı enjekte edilmiş ve davranış görevleri hayvanların test Örneğin, hipokampus bırakılabilir. Aβo ve tedavi İnfüzyon eş zamanlı olarak yapılan ya da alternatif tedavi Aβ birikimi sonra etkili olup olmadığını değerlendirmek için Aβo infüzyondan sonra monte edilebilir pompaları edilebilir. Aβo intraserebroventriküler infüzyon yaparken burada açıklanan aynı protokol de kullanılabilir. hücre içi sinyal yollarının üzerinde Aβo etkisi öncesi ve makul kısa bir zaman dilimi içinde nöronal kaybından sonra değerlendirilebilir. Aβ infüzyon dozu ve sayısı da daha çok ya da daha az ciddi Aβ patojenik elde etmek üzere ayarlanabilir.
çok yönlü olmasına rağmen, bu tekniğin bazı sınırlamalar vardır. Kanül implantasyon ameliyatı takip eden ilk birkaç gün içinde doku ve nöro mekanik bozulması üretir. Bu nedenle, Aβo INFU başlamadan önce ameliyat sonrası en az bir hafta beklemek gereklidirsion ve bu olaylar dikkate almak uygun kontroller (araç veya inaktif karıştırmak Aβ enjeksiyonu) ekleyin. Ayrıca, Aβo sadece küçük bir hacmi, solüsyonun difüzyon sınırlama infüze edilebilir.
ozmotik pompalar Aβ kaynaklı nörodejenerasyonu önlemek için tasarlanmış ajanlar klinik öncesi doğrulama için uygun ve özel dağıtım yöntemi temsil eder. 6E10 antikoru ile immünoterapi önce, beyinde 31 Aβ birikimi azalttığı gösterilmiştir beri biz yeni in vivo yaklaşım doğrulamak için bir proof-of-concept olarak 6E10 antikoru kullanılmıştır. Bu modelde ozmotik pompalar kullanılır artık klinik öncesi AD hastalarında Aβo birikmesini ve nörotoksisite önleyebilecek yeni hastalık modifiye tedavilerin geliştirilmesi için kullanılabilir.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De Sève master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Université de Montréal This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.
Materials
| Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
| PE50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylaxine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Meloxicam (5 mg/mL) | Norbrook | 215670I01 | |
| Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
| Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
| Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
| Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| 6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
| Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
| Hamilton syringe (10 µL) | Fisher Scientique | 14815279 | |
| Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
| Needle 21G | Terumo | NN-2125R | |
| Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |
Referenzen
- Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer’s disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
- Selkoe, D. J. Toward a comprehensive theory for Alzheimer’s disease. Hypothesis: Alzheimer’s disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 17-25 (2000).
- Terry, R. D., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991).
- Giannakopoulos, P., et al. Tangle and neuron numbers, but not amyloid load, predict cognitive status in Alzheimer’s disease. Neurology. 60, 1495-1500 (2003).
- Price, J. L., Morris, J. C. Tangles and plaques in nondemented aging and “preclinical” Alzheimer’s disease. Ann. Neurol. 45, 358-368 (1999).
- Reiman, E. M., et al. Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6820-6825 (2009).
- Aizenstein, H. J., et al. Frequent amyloid deposition without significant cognitive impairment among the elderly. Arch. Neurol. 65, 1509-1517 (2008).
- Mc Donald, J. M., et al. The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia. Brain. 133, 1328-1341 (2010).
- Tomic, J. L., Pensalfini, A., Head, E., Glabe, C. G. Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer’s disease brain and correlate with cognitive dysfunction. Neurobiol. Dis. 35, 352-358 (2009).
- Naslund, J., et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA. 283, 1571-1577 (2000).
- Hardy, J. Amyloid double trouble. Nat. Genet. 38, 11-12 (2006).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 101-112 (2007).
- McLean, C. A., et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).
- Hepler, R. W., et al. Solution state characterization of amyloid beta-derived diffusible ligands. Biochemie. 45, 15157-15167 (2006).
- Martins, I. C., et al. Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice. EMBO J. 27, 224-233 (2008).
- Lesne, S., et al. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 440, 352-357 (2006).
- Hung, L. W., et al. Amyloid-beta peptide (Abeta) neurotoxicity is modulated by the rate of peptide aggregation: Abeta dimers and trimers correlate with neurotoxicity. J. Neurosci. 28, 11950-11958 (2008).
- Ono, K., Condron, M. M., Teplow, D. B. Structure-neurotoxicity relationships of amyloid beta-protein oligomers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 14745-14750 (2009).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).
- Shankar, G. M., et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory. Nat. Med. 14, 837-842 (2008).
- Shankar, G. M., et al. Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J. Neurosci. 27, 2866-2875 (2007).
- Cleary, J. P., et al. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat. Neurosci. 8, 79-84 (2005).
- Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers. J. Physiol. 572, 477-492 (2006).
- Gomez-Isla, T., et al. Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer’s disease. J. Neurosci. 16, 4491-4500 (1996).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5, 417-421 (1996).
- Brouillette, J. The Effects of Soluble Abeta Oligomers on Neurodegeneration in Alzheimer’s Disease. Curr. Pharm. Des. 20, 2506-2519 (2014).
- Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-beta1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. J. Neurosci. 32, 7852-7861 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Broersen, K., et al. A standardized and biocompatible preparation of aggregate-free amyloid beta peptide for biophysical and biological studies of Alzheimer’s disease. PEDS. 24, 743-750 (2011).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 4501-4506 (2009).
- Papon, M. A., Whittington, R. A., El-Khoury, N. B., Planel, E. Alzheimer’s disease and anesthesia. Front. Neurosci. 4, 272 (2011).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
