İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

İnsan Araştırmaları Etik Mater Sağlık Hizmetlerinde Komiteleri, Royal Brisbane ve Kadın Hastanesi, Queensland Teknoloji Üniversitesi ve University of Queensland çalışmasında kullanılan insan plasenta örneklerinin araştırma ve toplama onayladı. Tüm protokoller ulusal araştırma kurallarına uyulması. Hastalar araştırma amaçlı doku kullanımı için yazılı onam İşletmesi. Üçüncü trimester plasenta Brisbane, Avustralya yukarıda belirtilen hastanelerden dönem rutin sezaryen (CS) doğum aşağıdaki sağlıklı annelerden elde edildi. vadeli örnekleri için erkek uyumsuz gebelikler anne hücreleri fetal ayırmak için bu çalışmada kullanılmıştır. Fetal cinsiyet önce doğum ve / veya klinik personeli tarafından doğumda yenidoğanın görsel muayeneye ultrason ile tespit edilmiştir. In situ hibridizasyon (FISH) X ve Y kromozomu floresan ayrıca cinsiyet ve korunmuş doku fetal veya maternal kökenini doğrulamak için kullanılmıştırOrijinal plasenta. 1. öncesinde Harvest, ardından hazırlayın Not: Enzim çözümleri yukarı yaparken, her bir ürün için üretici tarafından sağlanan özel gereksinimleri ve konsantrasyonları takip edilmelidir. Enzimler genellikle bu nedenle de farklı firmalardan benzer enzimler farklı etkinlikler / konsantrasyonları olması muhtemeldir, proteinlerin ham bir karışımı olarak temin edilmektedir. Bu nedenle, üreticilerin tavsiyelerine kabul edilmelidir ve çözelti hazırlama göre modifiye edilmesi gerekebilir. Hazırlayın ya da 1.5 ila 2 L toplam satın alma steril bu protokol için Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). kollajenaz tip I tartılmasıyla kolajenaz I stok çözelti hazırlayın ve yavaşça tam çözünmenin gerçekleşmesi için 1 mg / ml HBSS içinde ve vorteks çözülür. 100 birim (U) / ml (1,000x stok çözelti) kollajenaz çözüm getirmek ve daha sonra bir 0.2 kullanılarak filtre etmek için gerekli HBSS (kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden) hacminin belirlemek# 181; m şırınga filtresi. -20 ° C'de kısım 1 mi 1.5 ml tüpler içinde hacimleri ve mağaza kadar gerekli. kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) içinde 10 mg / ml steril olmayan dispaz eritilerek dispaz stok çözelti hazırlayın. Ayrıntılı 2.4 U / ml bir son konsantrasyona kadar kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile seyreltin. 0.2 mikron şırınga filtre ile sterilize filtre. -20 ° C'de kısım 1 mi 1.5 ml tüpler içinde hacimleri ve mağaza kadar gerekli. 0.15 M NaCl içerisinde 10 mg / ml'de DNase I çözülmesiyle deoksiribonükleaz (Dnase) -I stok çözelti hazırlayın. 0.2 um'lik bir şırınga filtreden filtre thorugh. -20 ° C'de kısım 1 mi 1.5 ml tüpler içinde hacimleri ve mağaza kadar gerekli. 100 U / ml kolajenaz türü birleştirerek çalışma sindirim çözeltisi hazırlayın I I.5 ug / ml DNase I ve 2,4 U / ml dispaz serumsuz DMEM. Taze defrost ve kullanımdan hemen önce, enzim stok seyreltin. Yaklaşık bir 1: sindirim çözeltisi 1 oranındaDoku hacmine gereklidir (50 ml tüp içinde ölçülen doku gibi 10 ml, sindirim çözeltisi 10 ml gereklidir). PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) içindeki bir çözeltisi hazırlandı ve pH, 7.4 ila 15 ayarlanır. Mağaza uzun süreli ya da 1 hafta boyunca 4 ° C 'de, -20 ° C'de 25 ml'lik örnekler. 1 x antibiyotik ve antimikotik çözelti ve% 10 ısıl inaktif fötal sığır serumu ile takviye edilmiş DMEM-düşük glikoz (DMEM-LG) MSC kültür ortamı hazırlayın. MSC dereceli FBS birçok FBS tedarikçilerden satın alınabilir. kurumsal rehberlere göre önceden diseksiyon ekipmanı sterilize otoklavlayın. Bu makas, forseps, neşter ve büyük bir metal diseksiyon tepsisi bulunmaktadır. Ek steril doku kültür plastik malzeme, sarf malzemeleri (örneğin neşter, 50 ml ve 15 mi borular, 25 mi, 10 mi, 5 ml pipet ve 75 ya da 175 cm2 hücre kültürü şişeleri) toplayın. bir sınıf II b: standart birincil hücre kültür laboratuvar ekipmanı kullanınPrimer hücre izolasyon için uygun iosafety dolabı, hücre kültürü kuluçka% 5 CO2 ve 37 ° C, 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir rocker ve 50 ml'lik tüplere kapasiteli bir santrifüj ayarlanır. kurumsal rehberlere göre bir laboratuvar önlüğü, (her zaman) eldiven 2 çift, koruyucu gözlük ve yakın parmaklı ayakkabı: Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. önceden kurumsal rehberlere ve sıvı biyolojik atık kapları göre insan kan örnekleri için uygun dekontaminasyon çözümleri hazırlayın. Plasental MSC 2. izolasyonu Plasenta hazırlanması gerekli kişisel koruyucu ekipman giydirin. enzimatik sindirim (bölüm 2.5.6) prosedürü kadar yürütmek için gerekli malzeme, çözümleri ve atık kapları ile biyolojik güvenlik kabini ayarlayın. aydınlatılmış onam ve etik onayı ile bir plasentayı edinin. sezaryen sn yoluyla plasentayı toplayınlaboratuara taşınması için steril torba ya da kova aseptik cerrahi koşullar altında tion, ve ambalaj. taşıma ve diseksiyon önce sırasında, oda sıcaklığında veya 4 ° C'de plasentayı saklamak. Not: doku hücre kültürünün performansını etkilemeden en fazla 6 saat süre ile depolanabilir. Plasenta toplama ve doku işleme mümkün arasındaki süreyi sınırlayın. Bu öneri pratik konular dayanmaktadır. Bazı durumlarda, biz doğumdan sonra 6 saat boyunca hücre izolasyon işlemi geciktirmiştir. Bu durumlarda plasenta oda sıcaklığında ya da 4 ° C (laboratuarda veya toplama merkezinde) tutulan edilmiştir. bunlar, 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında muhafaza edildiğinde hiçbir belirgin farklılıklara plasenta elde MSC, genel verici varyasyon üzerinde gözlenmiştir. biyolojik güvenlik kabini plasenta ile kap yerleştirin. Kabı açın ve steril bir tepsiye plasentayı aktarın. Fetal membranlar (amniyon kesesi ya da amniyon-koryonik laeve) 8 açılmaktadır. plasenta parçaları ile odaklı hale gelir. fetal yan merkezi plasenta takılı, genel olarak göbek kordonu ekleme vardır. Fetal yanının karşısında olduğu (Desidua basalis ile kaplı) maternal, belirgin kotiledonlar (ya da lob) sahiptir. diseksiyon başlamak için, steril tepside yukarı bakacak şekilde göbek kordonu ile plasentaya yolunuzu. Not: Bu protokol, üç doku tiplerinin her birinden bir T175 şişesi içine tohum için yeterli hücreleri elde etmek için tasarlanmıştır. Her bir özeti dokusunun yaklaşık 10 g ile başlar. Bu 20 mi, kemik iliği aspiratı başlatılan MSC kültürler olarak şişelere benzer bir başlangıç ​​sayıdır. daha fazla hücre istenirse, daha sonra, doku hasat edilebilir ve protokol doğrusal ölçeklendirilebilir. hasat edilecek doku boyutları plasenta dokusundan pratik olanın sadece gösterge niteliğindedir. Birkaç definin varBir referans noktası olarak kullanılabilir plasental villus, g özellikleri. belirtilen boyutlar bir tahmin olarak hizmet ve göbek kordonu fetal yüzey üzerinde bir dönüm noktası olarak kullanılır. Desidual (D) Doku Diseksiyon bu yüzden anne yüzey (desidua basalis) yukarı bakacak üzerinde plasentayı çevirin. göbek kordonu ekleme noktası fetal yan aşağı baktığından emin olun. plasenta (desidua basalis doku içeren) maternal taraftan 0,5 cm kalınlığında parçalar kesin. nemli doku parçaları tutmak için Diseksiyon sırasında HBSS içeren bir Petri kabı içine doku parçaları yerleştirin. (Bu doku yaklaşık 10 g), 50 ml'lik bir tüp içinde 10 ml işaretine kadar bir tüp doldurmak için yeterli bir doku aktarın. Koryon Plate diseksiyonu (CP) Doku Mekanik cho bırakarak, plasentanın (değil amniyon kesesi) fetal yüzeyinden amniyotik membran kaldırmakrionic frondosum (koryon plaka) bozulmamış. koryonik plaka derin 0,5 cm 1 cm genişliğinde ~ parçaları kesin. uzakta plasentanın kenarından, en yakın göbek kordonu bölgeye koryonik plaka hasat. hidrate tutmak için Diseksiyon sırasında HBSS içeren bir petri içine doku parçaları yerleştirin. 10 mi işaretine (~ 10 g doku) kadar 50 ml tüp doldurmak için yeterli bir doku aktarın. Koryon Villi diseksiyonu (CV) Doku CV doku ~ 1 cm CP zaten kaldırıldı plasenta dokusundan derin 2 x 0.5-1 cm parçalara ayır. Yine, uzak plasentanın kenarından bölgeye göbek kordonu yakın, hasat CV. (Desidua basalis doku içeren) plasentanın anne tarafında uzağa en az 1 cm kalmaya çalışın; amaç plasenta villus dokusunun iç doku hasat etmektir. disse sırasında HBSS içeren bir Petri kabı içine doku parçaları yerleştirinhidrate tutmak için ction. 10 mi işaretine (~ 10 g doku) kadar 50 ml tüp doldurmak için yeterli bir doku aktarın. Kıyma ve D CP enzimatik sindirimi ve CV Plasental Dokular D ~ 10 g olduğu gibi, CP veya CV dokuları, üç farklı 50 ml tüpler, HBSS yaklaşık 40 ml ile herbir tübe girip sürekli doku yıkamak için tüp ters (10 sn ~ için tekrar). Süpernatantı Durusu ve çözüm kandan büyük ölçüde boşalana kadar bu yıkama adımı 2-3 kez tekrarlayın. süpernatan ayrıldı sırasında doku parçaları tüp (ler) dışında kayıp değil emin olmak için bir 10 ml pipet veya uzun cımbız kullanın. en az bir sıvı transferi ile 10 cm'lik petri doku parçaları dönün. Chop / makas veya jilet ile yaklaşık 1-5 mm 3 ince parçalar halinde doku kıyma. geri uygun şekilde etiketlenmiş (D, CP veya CV) 50 ml tüpler içine kıyılmış doku aktarın. taze prepar ekledoku (örneğin, 10 ml doku ilave artı ortamı özet 10 mi) ile: 1 oranında ed en az 1 'de ortam sindirimi. Her tüp kapağı değiştirin ve karıştırmak için boruları birkaç kez ters çevirin. 37 ° C'de 1-2 saat boyunca ortam sindirimi tüpler dokuları inkübe edin. Nemlendirilmiş atmosfer ve% 5 CO2 Bu aşama için gerekli değildir. Not: Hızlı sarsıntı verimli MSC verimi doku hücreleri ayırmak ve üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Sınırlı verim 48 saat ve daha uzun 1-2 haftadan fazla bir birinci kanalı zamanda kültür şişesine bağlı çok az hücreleri tarafından belirgin olacaktır. Kuluçka süresi ve sallayarak yöntem laboratuvarda mevcut 37 ° C inkübatör bağlıdır ve optimizasyon gerektirebilir. hızlı ve kontrol edilebilir çalkalama mekanizması, yer dokusu ile bir inkübatör ve inkübatör 50 ml'lik bir tüp veya steril erlene, yerinde orta sindirmek ve 250 rpm hızı sallayarak ayarlayın. Bu tam bir Digest sonuçlanır1 saat doku. Seçenek olarak ise, hafif bir sallama ya da sallanan bir mekanizma ile bir inkübatör için, elle 10 sn 1,5 ila 2 saat süre ile, her 30 dakika boyunca elle hızlı ve kuvvetli bir şekilde tüp sallayın. Enzim Kuluçka dönemi, gereksiz öğeleri biyogüvenlik kabini temizleyin atık atmak kirli ise laboratuvar önlüğü değiştirebilir ve prosedürün bir sonraki bölümü için hazırlamak için uygun bir zamandır. Mononükleer Hücreleri Toplama ve parfümeri içine Kaplama Not: Bir önceki Aşama'daki, doku parçaları sindirilmesi ile üç adet 50 ml'lik tüp (D, CP veya CV) vardır. Doku özet çözüm bulutlu bir görünüm geliştikçe ve beyaz kan damarları dokuda belirgin olduğunda, sindirim tamamlanır. Dijestiyon çözeltisi içinde ihtiva edilen enzimleri inaktive her tüpe FBS içeren MSC medya 30 ml ekleyin. Büyük sindirilmemiş enkaz mononükleer hücreleri ayırmak için nabız 50 ml tüp santrifüj. Kısaca, izinsantrifüj 340 x ulaşmak için g 5 saniye sonra durur. Bu sıvı süspansiyon mononükleer hücreleri bırakarak, tüpün alt pelet büyük artıkları zorlar. Not: tüp sadece kısa bir süre (pulsed) santrifüj ise mononükleer hücreler sıvı fazda kalır. santrifüj uzatılırsa, tek çekirdekli hücreler, arzu edilmeyen hücre kaybı ile sonuçlanan, doku parçaları ile tüpün alt pelet olacaktır. mononükleer hücreleri içeren supernatant toplamak ve bir pipet ile yeni bir 50 ml'lik bir tüp içine, bu aktarın. Kalan plasental doku enkaz medya veya HBSS 30 ml ekleyin ve şiddetle çalkalanır. Bu süspansiyon içine kalan müstakil mononükleer hücreleri getirmek ve dokudan varsayılan MSC ikinci bir hasat sağlayacaktır. Darbe santrifüj tüpü ikinci kez ve yine yeni bir 50 ml'lik bir tüp süpernatantı aktarın. Bu adımı toplama verimliliğini en üst düzeye çıkarmak üçüncü kez tekrarlayınHer bir doku kaynağından mononükleer hücre. iki adet 50 ml'lik tüplere bağımsız doku tiplerinin her birinden süpernatantlar havuz. Bu toplam 6 tüpler (her D, CP ve CV 2 tüpleri) verecektir. Santrifüj 340 x g'de 5 dakika boyunca her bir tüp. Bu adım tüplerin altına mononükleer hücreler pelet olacaktır. Dikkatle süzün veya atık içine süpernatant pipetle. Süpernatant her damla ortadan kaldırmak için denemek için gereksizdir. Not: hücre topağı ise kırmızı kan hücrelerinin çok sayıda hassas olacaktır. 50 ml tüp doğrudan boşaltılarak eğer yanlışlıkla pelet atmak için dikkatli olun. süpernatant en çıkardıktan sonra, yavaşça hücre pelletini çıkarmak için bir parmak ile tüpü birkaç kez hafifçe vurun. buradaki her bir D, CP veya CV doku için tek bir tüp olup, böylece granül birleştirin ve MSC medya 35 ml, her yeniden süspanse edin. İsteğe bağlı: 100 mikron örgü hücre süzgecinden mononükleer kısmını filtre u set50 ml'lik bir tüp içinde bir p hücre kümeleri veya lifli malzemenin çıkarılması için. Not: Filtreler kolayca yapışmasına neden olabilir ve aşırı dolgu gibi bakım gereklidir. Ayrıca, hava kabarcıkları drenaj filtreleri engelleyebilir. Bu durum ortaya çıkarsa, yavaş yavaş hava, yeni bir filtreye hücre kültür ortamı veya değişim ile aracılığıyla filtre, filtre altında akmasına yıkamak için izin tüpün dışına filtreyi kaldırın. Filtreleme adımı hariç takip eden MSC kültürlerinin verimini ve kalitesini değiştirmek için görünmez. İsteğe bağlı olarak, bir kırmızı kan hücresi (RBC) parçalama veya yoğunluk gradyan santrifüj Bu aşamada 15 üzerinden gerçekleştirilebilir. Ancak, bizim deneyim RBC MSC eki ya da çoğalması ve bu nedenle RBC lizis müdahale kalmamasıdır gerekli değildir. RBC çıkarma 15 üzerinden gerçekleştirildiği takdirde Mononükleer hücreler bu aşamada sayılabilir. Her ne kadar, bu aşamada hücreler büyük çoğunluğu MSC, ancak fetal kökenli trofoblast, endotelial hücreler ve hematopoietik hücreleri, hem de ma olmayacakmodu, harici kökenli hematopoetik hücreleri ve desidual stromal hücreler. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, tek bir T175 şişeye ve kültür, her D, CP veya CV doku için hücre süspansiyonu aktarın ve% 5 CO2. Mesaj İzolasyon-hücre Genişleme İlk izolasyon aşağıdaki 48 saatte, şişeler (D, CP ve CV) her birinden orta kaldırmak ve taze MSC medya 35 ml ile değiştirin. Farazi MSC doku kültürü şişesi 16 bağlı olduğu varsayılan harcanır orta ve müstakil hücreleri, iptal edilebilir. Bir 24 saat daha kuluçka şişeler dönün. kültürün ek bir 24 saat sonra, enkaz ve eritrositlerde kaldırmak için DPBS (25 mi) ile iki kez şişeler yıkayın. Eritrositlerde çıkarmak için şişenin dibine etrafında sıvı girdap. sıvı ve enkaz kaldırmak için bir pipet kullanın. şişelere MSC medya 35 ml ekleyin ve inkübatör şişeler dönün. haftada iki kez, ve medya değiştirinhücre mono tabakaları kadar cubate kültürler 80-% 90 konfluent. Bu ilk genişletme doku kalitesine bağlı olarak, 4-14 gün sürer, Özet çözeltisi ile malzeme ve verimlilik ve inkübasyon süresi, başlangıç ​​miktarı. pMSCs 3. Alt kültür Kültürler% 80-90 ortak akışlı olduğunda, 20 ml 1x HBSS veya DPBS ile iki kez yıkayın ve yıkama atın. Her bir şişeye tripsin yerine ekleme (örneğin bir T175 şişeye 5 ml,). Doku kültürü yüzeyinden MSC serbest bırakmak için 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca şişeler inkübe edin. dekolmanı kolaylaştırmak için balonun yanlarnıı her ~ 2 dk dokunun. Hücreler yüzey ve tek bir hücre süspansiyonu müstakil zaman MSC medya ile şişeden hücreler yıkama ve tüplerde hücreleri toplamak. MSC medya sulandırmak ve (~ T175 şişesi başına MSC medya 15 ml kullanımı) tripsin yerine devre dışı kalır. 50, her bir doku kültürü şişesi içeriği aktarmaml tüp. 5 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj tüpleri pelet hücreleri. Süpernatant atılır ve MSC medya 1 ml hücre pelletleri tekrar süspansiyon. 10 ul tripan mavi ile hücre süspansiyonu 10 ul seyreltilir. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve hücrelerin 15 toplam sayısını hesaplayın. Taze MSC medya 1.150 hücre / cm2 yeni şişelere hücreleri transferi ve bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. Bu tohum ekme yoğunluğu MSC medya 35 ml her yeni T175 şişesi içine 200,000 MSC tohum. % 80-90 konfluent kadar haftada iki kez hücreleri beslemek. 1150 hücre / cm 2 veya her T175 balona 200.000 MSC daha sonraki pasajlar Tohum. Ne zaman Passage 1 (P1) ya da P2 hücreleri ileride kullanılmak üzere hücrelerin çoğunluğunu cryopreserve ve daha fazla yayılması ve karakterizasyonu için tek T175 şişesi reseed, birleşmiş olan. çoğaltılan hücreler fl yoluyla mezodermal farklılaşma tahlilleri ve hücre karakterizasyonu için P3 veya P4 de kullanılabilirow sitometri. Not: Erken pasajlarda, orada çok az seyrek ayrılmış koloniler olabilir, ama her koloninin içindeki yerel hücre yoğunluğu çok yüksek olabilir. hücrelerin lokal yoğun ambalaj büyümesini geciktirerek ve kültür performansı azaltarak, temas inhibisyonu neden olacak gibi bu, ideal değildir. Bu yoğun kolonileri gözlenir, hücreler hasat edilmiş ve yeni bir şişe içine tohumlandı gerektiğini tavsiye. Bu yeniden dağıtım işlemi çoğalmaya oda hücreleri sağlar ve genel kültür performansı artacaktır. MSC dondurularak saklanabilmesi,% 90 FCS ve% 10 dimetilsülfoksit (DMSO), 1 ml için 1 x 10 6 hücre toplanması ve standart protokoller kullanılarak dondurma. Not: temsilcisi sonuçları bölümünde, üç farklı (D, CP ve CV) genişletilmiş hücre popülasyonlarının cinsiyetini belirlemek için akış sitometri kullanılarak MSC karakterizasyonu, mezodermal farklılaşma ve XY FISH analizi açıklamaları vardır. Çalışmamızda, plasenta erkek bebekler vardı; böylece tümFetal hücreler erkek (Y kromozomu) olarak ayırt edilebilir ve tüm anne hücreleri (sadece X kromozomu) dişi olarak ayırt edilebilir.